circFTO binding with IGF2BP2 regulates trophoblast cells proliferation, migration, and invasion while mediating m6A modification of CCAR1 mRNA in spontaneous abortion

1. 领域背景与文献

文献英文标题：circFTO binding with IGF2BP2 regulates trophoblast cells proliferation, migration, and invasion while mediating m6A modification of CCAR1 mRNA in spontaneous abortion；发表期刊：BMC Molecular and Cell Biology；影响因子：未公开；研究领域：生殖医学（自然流产分子机制与生物标志物研究）。

自然流产是临床常见的生殖系统疾病，指妊娠28周前、胎儿体重不足1000g时发生的妊娠终止，其中85%为妊娠12周前的早期流产，其病因涵盖遗传异常、解剖结构异常、内分泌紊乱、自身免疫异常等多个维度，但仍有近50%的病例发病机制尚未明确。领域共识：滋养细胞是胎盘组织的核心功能细胞，胚胎植入后细胞滋养层可分化为绒毛外滋养层，后者通过侵袭子宫肌层、重塑螺旋动脉为胚胎发育提供营养支持，滋养细胞增殖、迁移、侵袭功能异常是导致自然流产的核心细胞学基础。近年来非编码RNA的调控作用成为生殖疾病研究的热点，其中环状RNA因具有共价闭环结构，不易被核酸酶降解，在体液和组织中稳定性较高，已被证实可作为多种疾病的诊断标志物和治疗靶点，但目前环状RNA在自然流产中的功能与调控机制研究仍较少，尤其是其参与N6-甲基腺苷（m6A）修饰调控的相关机制尚未明确，缺乏可用于临床转化的特异性靶点。本研究针对该研究空白，聚焦环状RNA circFTO在自然流产中的作用，阐明其调控滋养细胞功能的分子机制，为自然流产的诊断和治疗提供新的理论依据。

2. 文献综述解析

本研究的文献综述按照“疾病病理→细胞功能→分子调控”的层级逻辑展开，首先梳理自然流产的流行病学特征与已知病因，明确不明原因自然流产的临床诊疗需求；其次聚焦滋养细胞功能异常在自然流产发生中的核心作用，总结非编码RNA调控滋养细胞表型的研究进展；最后归纳环状RNA的常见作用机制，以及m6A修饰在妊娠维持中的调控功能，指出现有研究的不足。

现有研究的支持结论包括：环状RNA在人类胎盘组织中广泛表达，部分差异表达的环状RNA可通过调控滋养细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力参与自然流产的发生；胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）作为经典的m6A阅读器，可通过识别靶mRNA的m6A修饰位点提升其稳定性，已有研究证实该蛋白表达下调与自然流产发病相关；胎盘组织整体m6A修饰水平异常可导致滋养细胞功能障碍，参与妊娠相关疾病的发生。现有研究的技术优势包括：高通量RNA测序技术可高效筛选临床样本中差异表达的环状RNA，滋养层类器官模型可较好模拟体内胎盘的生理结构和功能，提升研究结果的临床转化价值。现有研究的局限性包括：已报道的自然流产相关环状RNA的功能验证多局限于细胞系水平，缺乏类器官或动物模型的体内验证；多数研究仅揭示环状RNA的microRNA海绵调控机制，对其结合RNA结合蛋白、参与表观修饰调控的机制研究较少；环状RNA作为自然流产生物标志物的临床验证样本量普遍较小，缺乏多中心队列的诊断效能数据。

本研究的创新价值在于首次发现circFTO在自然流产患者胎盘绒毛组织中显著上调，突破了现有研究对环状RNA调控机制的认知局限，阐明了circFTO通过结合IGF2BP2促进其泛素化降解，进而调控下游靶mRNA的m6A修饰和稳定性的全新通路，同时采用滋养层类器官模型验证功能，为自然流产的机制研究和靶点开发提供了新的方向。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的核心目标是明确circFTO在自然流产发生中的功能及分子调控机制，核心科学问题为“circFTO如何通过调控滋养细胞生物学功能参与自然流产的发生”，技术路线遵循“临床样本差异筛选→细胞功能验证→类器官水平验证→分子机制探究→下游靶点验证”的闭环逻辑，研究结果相互支撑，证据链完整。

3.1 环状RNA差异表达筛选与验证

本环节的核心目标是筛选自然流产患者胎盘绒毛组织中差异表达的环状RNA，并验证目标分子的表达水平。实验方法：采集4例自然流产患者和4例正常妊娠女性的胎盘绒毛组织进行全转录组测序，以表达倍数变化>1.0、P<0.05为阈值筛选差异表达环状RNA；进一步扩大临床样本量（50例自然流产患者、76例正常妊娠女性），采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证circFTO的表达水平。结果解读：测序结果显示自然流产组共有95个环状RNA上调、43个下调，差异环状RNA的染色体分布见下图，

qRT-PCR验证结果显示自然流产组胎盘绒毛中circFTO（hsa_circ_0005941）的表达水平较正常妊娠组显著升高（P<0.001，n=126），见下图。

实验所用关键产品：Accurate Biotechnology的RNAex Pro Reagent、Yeasen Biotech的Hifair III 1st Strand cDNA合成试剂盒、qPCR SYBR Green预混液。

3.2 circFTO对滋养细胞功能的调控验证

本环节的核心目标是明确circFTO对滋养细胞增殖、迁移、侵袭功能的调控效应。实验方法：采用HTR-8/Svneo、JEG-3两株常用滋养细胞系，通过小干扰RNA（siRNA）敲低circFTO表达、过表达质粒上调circFTO表达；采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测细胞增殖能力，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力；同时构建正常妊娠来源的滋养层类器官，经苏木精-伊红染色（HE染色）、免疫组化（IHC）验证其组织来源后，转染circFTO过表达慢病毒，采用CellCounting-Lite 3D发光试剂盒检测类器官的增殖能力。结果解读：敲低circFTO可使滋养细胞增殖率显著升高，迁移和侵袭能力增强，过表达circFTO则显著抑制上述功能（n=3，P<0.05），见下图，

滋养层类器官过表达circFTO后，增殖能力较阴性对照组显著降低（n=3，P<0.001），见下图。

实验所用关键产品：RiboBio的小干扰RNA、Syngentech的circFTO过表达质粒、Saisofi的过表达慢病毒、Yeasen Biotech的CCK-8试剂盒、Vazyme的CellCounting-Lite 3D发光试剂盒、Corning的Transwell小室、BD的Matrigel基质胶；文献未提及滋养层类器官培养的具体培养基品牌，领域常规使用商业化滋养层类器官专用培养基。

3.3 circFTO结合蛋白的筛选与验证

本环节的核心目标是筛选并验证circFTO结合的RNA结合蛋白，明确其调控下游分子的中间靶点。实验方法：通过ENCORI、RBPsuite在线数据库预测circFTO的潜在结合蛋白；采用RNA免疫沉淀（RIP）实验验证circFTO与IGF2BP2的结合作用；采用蛋白免疫印迹法检测circFTO表达改变对IGF2BP2蛋白水平的影响；采用蛋白酶体抑制剂MG132处理、泛素化免疫沉淀实验，验证circFTO调控IGF2BP2的降解途径。结果解读：生物信息学预测显示IGF2BP2为circFTO的高置信度结合蛋白，RIP实验显示IGF2BP2富集的circFTO水平较免疫球蛋白G（IgG）对照组显著升高（n=3，P<0.01）；敲低circFTO可使IGF2BP2蛋白水平升高，过表达circFTO则显著降低IGF2BP2蛋白水平（n=3，P<0.05），见下图，

MG132处理可逆转circFTO过表达导致的IGF2BP2降解，泛素化实验显示circFTO可促进IGF2BP2的泛素化修饰，进而通过蛋白酶体途径降解（n=3，P<0.05），见下图。

实验所用关键产品：Proteintech的IGF2BP2抗体（货号11601-1-AP）、泛素抗体（货号10201-2-AP）、Bimake的Protein A/G磁珠、Beyotime的免疫沉淀裂解液、Selleck的MG132。

3.4 IGF2BP2介导circFTO功能的挽救实验

本环节的核心目标是验证IGF2BP2是否介导circFTO对滋养细胞功能的调控作用。实验方法：在JEG-3细胞中共转染circFTO小干扰RNA和IGF2BP2小干扰RNA，采用CCK-8、Transwell实验检测细胞增殖、迁移、侵袭能力的改变。结果解读：敲低IGF2BP2可部分逆转circFTO敲低诱导的滋养细胞增殖、迁移、侵袭能力升高（n=3，P<0.05），证实IGF2BP2是circFTO调控滋养细胞功能的关键下游靶点，见下图。

受实验期间疫情导致的试剂采购限制，本实验仅在2株领域通用的滋养细胞系中完成，结果具有一致性和可靠性。实验所用关键产品与前述细胞功能实验一致。

3.5 circFTO调控下游m6A修饰与靶基因验证

本环节的核心目标是明确circFTO通过IGF2BP2调控的下游靶基因及m6A修饰机制。实验方法：采用m6A甲基化定量试剂盒检测circFTO表达改变对滋养细胞整体m6A水平的影响；采用转录抑制剂放线菌素D处理细胞，检测细胞周期与凋亡调节因子1（CCAR1）mRNA的稳定性；通过SRAMP在线数据库预测CCAR1 mRNA的m6A修饰位点，采用甲基化RNA免疫沉淀联合qRT-PCR（meRIP-qRT-PCR）检测circFTO对CCAR1 mRNA m6A修饰水平的影响。结果解读：敲低circFTO可使滋养细胞整体m6A水平升高，过表达circFTO则降低m6A水平（n=3，P<0.05）；敲低circFTO可增强CCAR1 mRNA的稳定性，敲低IGF2BP2则降低其稳定性（n=3，P<0.05），见下图，

meRIP-qRT-PCR结果显示，敲低circFTO可使CCAR1 mRNA的m6A修饰水平升高，过表达circFTO则降低其修饰水平（n=3，P<0.05），见下图。

实验所用关键产品：EpiGentek的m6A RNA甲基化定量试剂盒、MilliporeSigma的m6A抗体（货号ABE572-I）、Selleck的放线菌素D。

4. Biomarker 研究及发现成果

本研究鉴定的核心生物标志物为circFTO（hsa_circ_0005941），属于环状RNA类生物标志物，筛选验证逻辑遵循“测序初筛→大样本临床验证→功能验证→机制明确”的完整链条，具有较好的临床转化潜力。

circFTO的筛选与验证均以临床胎盘绒毛组织为样本，初筛阶段采用4对自然流产与正常妊娠的配对样本进行RNA测序，获得差异表达分子后，在126例临床样本（50例自然流产、76例正常妊娠）中进行qRT-PCR验证，后续通过细胞系、滋养层类器官的功能实验明确其生物学效应，通过分子生物学实验阐明其调控机制。临床样本验证显示circFTO在自然流产组的表达上调具有显著统计学差异（P<0.001，n=126），文献未明确提供该标志物的诊断敏感性、特异性及ROC曲线数据，需进一步扩大临床样本验证。

本研究的核心成果包括：circFTO在自然流产患者胎盘绒毛中显著上调，可通过结合IGF2BP2促进其泛素化降解，进而降低CCAR1 mRNA的m6A修饰水平和稳定性，抑制滋养细胞增殖、迁移、侵袭能力，最终导致自然流产发生；circFTO-IGF2BP2-CCAR1调控轴是自然流产发生的全新机制，circFTO可作为自然流产的潜在诊断标志物和治疗靶点。所有功能和机制实验均独立重复3次，组间差异P<0.05具有统计学意义，临床验证样本量为126例。推测：circFTO未来可开发为外周血检测标志物，进一步提升自然流产早期诊断的便捷性。