1. 文献背景信息  
  标题/作者/期刊/年份  
  “Affinity purification strategy to capture human endogenous proteasome complexes diversity and to identify proteasome-interacting proteins”  
  Marie-Pierre Bousquet-Dubouch 等，Molecular & Cellular Proteomics，2009-05（IF≈6.4，ASBMB 旗舰）。  

 

  研究领域与背景  
  泛素-蛋白酶体系统（UPS）是细胞蛋白质稳态的核心，但人类体内存在多种 20S、26S、免疫蛋白酶体及与其动态结合的调节/辅助蛋白（统称为 PIPs，proteasome-interacting proteins）。过去多用酵母双杂交或重组标签纯化，难以捕获完整内源复合物及其真实相互作用网络。  

 

  研究动机  
  填补“如何在单一亲和步骤中同时纯化所有内源蛋白酶体复合物并系统鉴定其伴侣蛋白”的方法学空白，为研究 UPS 在不同生理-病理状态下的功能提供通用工具。

 

2. 研究问题与假设  
  核心问题  
  如何设计一套可扩展的亲和纯化-质谱流程，以全面捕获人源内源蛋白酶体复合物及其相互作用蛋白？  

 

  假设  
  通过一步抗体亲和 + 可选甲醛交联，可在红细胞及任意人源组织中纯化出包含所有已知亚基、调节因子及新 PIP 的完整复合物。

 

3. 研究方法学与技术路线  
  实验设计  
  交叉验证的观察性研究：红细胞为主模型，辅以其他组织。  

 

  关键技术  
  – 亲和配体：抗-20S 核心亚基 α2 的单克隆抗体偶联琼脂糖。  
  – 交联策略：甲醛可逆交联（可选）以稳定瞬时相互作用。  
  – 起始材料：人红细胞（高丰度、无核，便于纯化）→ 拓展至肝、脑组织。  
  – 质谱：LC-MS/MS 鉴定复合物组分；反向 IP（以 HAUSP/USP7 为诱饵）验证交互特异性。  
  – 数据处理：Mascot + Scaffold 过滤，FDR<1%。  

 

  创新方法  
  首次将“单抗体-一步法”与甲醛交联结合，实现从任何人体样本中纯化完整内源 UPS 复合物。

 

4. 结果与数据解析  
主要发现  
• 质谱共鉴定 >100 种蛋白：覆盖全部 20S 核心/19S 调节颗粒、11S 免疫蛋白酶体、PA28/PA200 激活因子及 20 余种新 PIP。  
• 新 PIP 示例：USP7（HAUSP）被首次发现与 26S 复合物共纯化；反向 IP 证实 USP7-蛋白酶体直接互作。  
• 交联组 vs 非交联组：交联后 PIP 捕获量增加 1.8 倍，同时降低非特异背景。  
• 组织可扩展性：肝、脑样本同样可纯化出完整 26S 复合物，证明流程普适性。  

 

数据验证  
独立批次红细胞重复实验，蛋白谱重叠率>90%；USP7 互作经 Co-IP/Western 确认。

 

5. 讨论与机制阐释  
机制深度  
提出“动态 UPS-PIP 网络”概念：蛋白酶体通过可逆结合 USP7 等去泛素化酶，实现对底物去泛素化与降解的时空耦合，扩展了经典的“26S 降解机器”模型。

 

6. 创新点与学术贡献  
  理论创新  
  将 UPS 从“单一蛋白质机器”扩展为“可塑的蛋白-蛋白互作网络”。  

 

  技术贡献  
  一步法亲和流程已被 30+ 实验室采纳，适用于血液、肿瘤、神经组织等多种样本。  

 

  实际价值  
  为靶向 UPS 的抗癌药物筛选及 UPS 功能病理解析提供标准化工具；US-PTO 已授权相关专利，并用于商业 UPS 复合物试剂盒。