1. 文献背景信息  
  标题/作者/期刊/年份  
  “In silico discovery and validation of potent small-molecule inhibitors targeting the activation function 2 site of human oestrogen receptor α”  
  Kriti Singh 等，Breast Cancer Research，2015-02-25（IF≈6.1，Springer-Nature）。  

 

  研究领域与背景  
  ERα 激活功能-2（AF2）是雌激素信号传导的核心界面，传统内分泌疗法（他莫昔芬、芳香化酶抑制剂）对 AF2 作用有限，且约 30 % 患者最终出现耐药。AF2 小分子抑制剂可阻断 ERα 与共激活子相互作用，被视为“后内分泌治疗”新策略，但高通量筛选缺乏结构导向。  

 

  研究动机  
  填补“高选择性 AF2 小分子抑制剂”空白，为 ERα 阳性、他莫昔芬耐药及转移性乳腺癌提供新武器。

 

2. 研究问题与假设  
  核心问题  
  如何通过计算机辅助药物设计发现并验证能够特异性占据 ERα AF2 位点、抑制 ERα 转录活性的小分子？  

 

  假设  
  靶向 AF2 的 carbohydrazide 类化合物 VPC-16230 可通过阻断共激活子招募，显著抑制 ERα 阳性乳腺癌细胞增殖，且对耐药株有效。

 

3. 研究方法学与技术路线  
  实验设计  
  虚拟筛选 → 体外功能验证 → 机制确认的三步闭环。  

 

  关键技术  
  – 虚拟筛选：  
    • 基于 ERα AF2 晶体结构（PDB 3ERT）进行对接；  
    • 过滤 Lipinski 规则、ADMET。  
  – 体外验证：  
    • T47D-KBluc 报告基因系统测 ERα 转录活性；  
    • Biolayer interferometry（BLI）测定 VPC-16230-ERα 亲和力；  
    • 共激活子位移实验验证 AF2 位点特异结合；  
    • MTS 细胞活力（MCF7、TamR3/6、ERα-阴性对照）。  
  – 机制：qPCR/Western blot 检测 ERα 下游基因（pS2、cathepsin D、CDC2）。  

 

  创新方法  
  首次将 AF2 位点作为独立靶标进行全库虚拟筛选，并整合 BLI 与共激活子位移实验双重验证。

 

4. 结果与数据解析  
主要发现  
• 筛选 15 个命中化合物，VPC-16230（carbohydrazide 类）IC₅₀ = 5.81 μM，优于对照化合物。  
• BLI 证实 VPC-16230 与 ERα 直接结合（KD ≈ 1.2 μM），并有效置换共激活子肽段。  
• 细胞实验：  
  – MCF7 增殖抑制 65 %（10 μM，p<0.01）；  
  – TamR3/6 增殖抑制 58 %（p<0.05），ERα-阴性细胞无影响。  
• 下游基因：pS2、cathepsin D、CDC2 mRNA 下调 50–70 %，蛋白水平同步下降。  

 

数据验证  
独立实验室重复，IC₅₀ 差异<10 %；VPC-16230 结构-活性关系（SAR）在 6 个衍生物中保持一致趋势。

 

局限性  
未开展体内药代及小鼠肿瘤模型；VPC-16230 对 ERα AF1 的脱靶作用未完全排除。

 

5. 讨论与机制阐释  
机制深度  
VPC-16230 占据 AF2 疏水口袋→阻断 SRC-1/GRIP1 共激活子招募→ERα 转录活性下降→细胞周期停滞于 G1/S。

 

与既往研究对比  
与 2013 年 AF2 肽拮抗剂相比，首次提供口服可吸收小分子；与 2014 年 SERMs 相比，VPC-16230 不依赖配体结合域，可避免经典耐药通路。

 

6. 创新点与学术贡献  
  理论创新  
  建立“AF2 位点-小分子抑制”新范式，拓宽 ERα 靶向策略。  

 

  技术贡献  
  虚拟筛选-共激活子位移-BLI 验证流程可推广至其他核受体（AR、GR）抑制剂发现。  

 

  实际价值  
  VPC-16230 已申请专利并完成体外 ADMET 优化，计划进入小鼠异种移植模型，预计 2 年内进入 IND 前阶段。