基于转录组学和三维成像的人体皮肤淋巴管系统表征

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Transcriptomics- and 3D imaging–based characterization of the lymphatic vasculature in human skin；

发表期刊：未明确提供；影响因子：未公开；研究领域：人体皮肤淋巴管生物学，属于淋巴血管系统形态与组学研究方向。

领域共识：过去六十余年，基于成像技术的研究已经构建了小鼠外周组织（如皮肤）淋巴网络的经典模型，将输入淋巴管按照功能分为毛细淋巴管、前收集淋巴管、收集淋巴管三个区段：毛细淋巴管以盲端起始，由橡树叶形淋巴内皮细胞组成，通过不连续的纽扣样连接形成开放入口，负责摄取组织液、大分子和白细胞；收集淋巴管位于毛细淋巴管下游，内皮细胞通过连续的拉链样连接连接，周围被淋巴平滑肌细胞覆盖，管腔内存在瓣膜保证淋巴单向流动。近年来单细胞RNA测序技术的发展，已经帮助研究者在小鼠输入淋巴管中解析出淋巴内皮细胞的亚群分类与基因表达差异，进一步完善了小鼠淋巴系统的分子特征。

当前研究存在的核心问题是，现有结论大多来源于小鼠模型，针对人体组织淋巴管系统的组成、结构与细胞异质性的研究非常有限。一方面人体样本获取难度大，三维成像研究起步晚；另一方面，内皮细胞本身仅占组织细胞的极小比例，淋巴内皮细胞的占比远低于血管内皮细胞，过往针对人体皮肤、乳腺等组织的单细胞RNA测序研究仅捕获到数千个淋巴内皮细胞，未对其亚群特征进行深入分析，因此目前对人体输入淋巴管中淋巴内皮细胞亚群的分类与解剖定位认识非常有限。

本研究针对这一研究空白，结合三维成像技术与单细胞RNA测序，对人皮肤和皮下脂肪组织的淋巴管系统进行深度解析，旨在明确人与小鼠皮肤淋巴管的组织与分子特征差异，为理解淋巴水肿等人类淋巴相关病理过程提供基础研究依据。

2. 文献综述解析

作者将现有领域研究按照技术方向分为基于成像的形态学研究和基于单细胞转录组的细胞亚群研究两类，分别梳理了两类研究的进展与局限性。对于形态学研究，现有研究通过共聚焦、多光子成像对小鼠多种组织（气管、耳皮肤、肠、肠系膜、膈肌等）的全组织包埋样本进行分析，明确了不同区段淋巴管的连接特征、平滑肌覆盖特点，构建了当前领域普遍认可的淋巴网络结构模型，但这类研究几乎都围绕小鼠组织展开，仅少数研究开始使用三维成像技术分析人体组织，缺乏系统的人体淋巴管结构特征描述。

对于单细胞转录组研究，现有小鼠研究已经清晰解析了输入淋巴管和淋巴结中淋巴内皮细胞的基因表达差异与亚群分类，明确了不同亚群的分子标记；针对人体的研究中，仅两项研究对从人类淋巴结分离的淋巴内皮细胞亚群进行了详细描述，而针对皮肤等外周组织的研究，由于淋巴内皮细胞占比极低，现有研究仅获得少量淋巴内皮细胞，未对其亚群分类和特征进行深入分析，无法满足对人体淋巴管异质性研究的需求。

通过对现有研究的梳理，作者明确了当前领域的核心缺陷：缺乏针对人体外周组织淋巴管结合高分辨率三维成像与深度单细胞转录组的系统研究，无法明确人体淋巴管的细胞组成、空间结构与小鼠模型的差异，而这种差异对理解人类淋巴相关疾病至关重要。本研究的创新价值在于，通过流式富集获得了足量的人体皮肤淋巴内皮细胞，获得了超过2万个细胞的单细胞转录组数据，结合深度三维成像系统解析了人皮肤淋巴管的特征，明确了人与小鼠的关键差异，还首次鉴定了CD24作为淋巴瓣膜的新型标记分子，并验证了其在瓣膜发育中的功能，填补了人体外周淋巴管研究的空白。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标是解析人皮肤和皮下脂肪组织淋巴管系统的细胞组成与空间结构特征，核心科学问题是明确人淋巴内皮细胞的亚群分类、空间定位，以及人与小鼠淋巴管的结构与分子差异，技术路线遵循“形态观察→分子分型→功能验证”的逻辑闭环：首先通过三维共聚焦和光片成像分析人皮肤和皮下组织淋巴管的整体分布与结构特征，然后通过流式分选富集淋巴内皮细胞进行单细胞RNA测序，解析细胞亚群分类与基因表达特征，最后对关键亚群和新型标记分子进行功能验证，明确其生物学作用。

3.1 人皮肤与皮下脂肪组织淋巴管的三维成像分析

实验目的：明确人皮肤和皮下脂肪组织中淋巴管的分布、密度、平滑肌覆盖特征以及标记分子表达模式。方法细节：获取整形手术剩余的正常人体皮肤和皮下脂肪组织样本，制备厚度200μm的皮肤全组织包埋，对淋巴管标记分子平足蛋白（PDPN）、淋巴管透明质酸受体1（LYVE-1），血管标记分子血管性血友病因子（vWF）、平滑肌标记分子α-平滑肌肌动蛋白（aSMA）进行免疫荧光染色，分别使用共聚焦显微镜和光片显微镜进行三维成像，对二维切片中的淋巴管和血管数量、面积进行定量统计分析。结果解读：共聚焦成像结果显示，人真皮浅层和皮下脂肪组织中存在大量盲端毛细淋巴管，多分布在血管附近，皮肤中几乎所有淋巴管均为aSMA阴性，仅在皮下脂肪组织中偶尔观察到aSMA阳性的收集淋巴管（图1）。定量结果显示，皮下脂肪组织中淋巴管数量约为皮肤的1/10，血管数量是淋巴管的10-20倍（n=3，P<0.05）（图S1）。光片成像可穿透至真皮2.2mm深度，结果显示人真皮中所有淋巴管均为PDPN+LYVE-1+，未发现小鼠皮肤中常见的PDPN+LYVE-1-收集淋巴管，且绝大多数淋巴管为aSMA阴性，仅在超过6例不同供者的样本中检测到1例aSMA+vWF-的收集淋巴管，提示人皮肤中平滑肌覆盖的收集淋巴管非常稀少，皮下脂肪组织中收集淋巴管也极为少见（图2）。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用免疫荧光染色试剂、共聚焦显微镜、光片显微镜仪器。

3.2 人皮肤淋巴内皮细胞的单细胞转录组测序与亚群分类

实验目的：解析人皮肤和皮下淋巴内皮细胞的异质性，明确淋巴内皮细胞的亚群分类与各亚群的分子特征。方法细节：从7例健康供者的皮肤和皮下脂肪组织分离基质血管组分，通过流式细胞分选获得活的CD45-CD31+PDPN+淋巴内皮细胞，使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序，对测序数据进行质量控制、批次校正后，进行无监督聚类，根据已知标记分子对细胞亚群进行注释，分析不同组织中各亚群的比例差异。结果解读：共获得21374个高质量淋巴内皮细胞，无监督聚类将其分为7个亚群，分别为2个毛细淋巴管亚群（cap1、cap2）、2个前收集淋巴管亚群（precoll1、precoll2）、1个收集淋巴管亚群、1个瓣膜亚群、1个增殖亚群（图3）。所有亚群均表达泛内皮细胞基因和泛淋巴管标记基因，其中增殖亚群仅占总细胞的0.4%，高表达增殖标记分子MKI67和AURKB；瓣膜亚群高表达瓣膜标记分子CLDN11、GJA4、GJA1、FOXC2；收集淋巴管亚群高表达趋化因子清除受体ACKR4；毛细淋巴管亚群高表达LYVE1和CCL21，且表达水平从前收集淋巴管、收集淋巴管到瓣膜逐渐降低。亚群比例分析显示，两个前收集淋巴管亚群合计占皮肤淋巴内皮细胞的51%，占皮下脂肪的55%；收集淋巴管亚群在皮下脂肪占比为8.4%，显著高于皮肤的2.6%（调整后P<0.05），瓣膜亚群占比在两种组织中相近，皮肤中瓣膜/收集淋巴管比例为3.02，是皮下脂肪的4倍以上，与成像结果中皮肤收集淋巴管稀少的结论一致。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用流式分选试剂、10x Genomics单细胞测序试剂盒、生物信息学分析软件。

3.3 真皮初始毛细淋巴管的连接可塑性与特殊功能亚群鉴定

实验目的：明确人真皮初始毛细淋巴管内皮细胞的形态与连接特征，解析两个毛细淋巴管亚群的功能差异。方法细节：使用VE-钙粘蛋白染色显示细胞连接，共聚焦成像观察人真皮初始毛细淋巴管的连接形态；对两个毛细淋巴管亚群进行差异表达分析和通路富集，通过体外机械拉伸实验验证机械力对标记分子表达的影响，通过免疫荧光染色验证关键分子的表达。结果解读：成像结果显示，人真皮初始毛细淋巴管同时存在两种形态的内皮细胞和连接：一种是经典的橡树叶形态内皮细胞，连接为不连续的纽扣样；另一种是拉长的内皮细胞，连接为连续的拉链样，说明人初始毛细淋巴管存在混合的连接状态（图4）。差异表达分析显示，cap2亚群中LYVE1和CCL21表达显著降低，高表达细胞-基质黏附、黏着斑组装相关通路分子，包括多种整合素、原纤维蛋白1（锚定纤维的主要成分）、以及机械信号转导相关分子如黏着斑激酶（FAK）、YAP1、TAZ等。体外机械拉伸实验显示，拉伸后淋巴内皮细胞发生伸长，长径比显著增加（n=3，P<0.001），同时LYVE1和CCL21表达显著下调（n=3，P<0.01），与cap2亚群的表达特征一致，提示cap2是一个机械激活的、特化结合细胞外基质的毛细淋巴管亚群，可能在间质压力升高时维持毛细淋巴管开放，促进组织液摄取。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用细胞培养试剂、机械拉伸生物反应器、定量PCR仪器。

3.4 真皮淋巴管瓣膜的特征与瓣膜内皮细胞亚群解析

实验目的：明确人真皮淋巴管瓣膜的分布特征，解析瓣膜淋巴内皮细胞的亚群分类与基因表达特征，明确剪切力对亚群分化的影响。方法细节：通过光片成像和共聚焦成像观察人真皮中PROX1、FOXC2、VE-钙粘蛋白染色显示瓣膜结构，定量分析瓣膜周围内皮细胞的形态；对瓣膜亚群进行亚聚类分析，结合差异表达明确两个亚群的基因特征，通过免疫荧光验证标记分子的定位，通过体外流场实验分析不同剪切力对基因表达的影响，验证亚群特征与剪切力的关系。结果解读：尽管人真皮中收集淋巴管稀少，但单细胞RNA测序结果显示瓣膜亚群占淋巴内皮细胞的比例达6.2%，成像结果证实人真皮上层甚至盲端毛细淋巴管附近都存在大量瓣膜结构，这些瓣膜位于前收集淋巴管，不存在平滑肌覆盖，瓣膜周围大多数内皮细胞为橡树叶形或混合形，很少为拉长形，符合前收集淋巴管的表型特征（图5）。亚聚类将瓣膜亚群分为两个亚群，其中亚群1高表达GJA1、ITGA9、NEO1、CD24，对应瓣膜小叶上游的内皮细胞；亚群2高表达GJA4、CLDN11、FOXC2、ANGPT2，对应瓣膜小叶下游内皮细胞，免疫荧光成像证实CD24和NEO1共定位于上游瓣膜小叶，FOXC2主要表达于下游瓣膜小叶（图6）。体外流场实验显示，上游瓣膜亚群的基因表达特征与层流剪切应力处理的淋巴内皮细胞相关性更高，下游亚群与振荡剪切应力或静态条件下的细胞相关性更高，说明层流剪切应力是造成两个亚群基因表达差异的重要原因之一。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用平行板流腔实验系统、转录组测序平台。

3.5 CD24的功能验证

实验目的：明确CD24在淋巴管瓣膜发育中的生物学功能。方法细节：通过流式细胞术和免疫荧光验证CD24在人皮肤淋巴管瓣膜的特异性表达；在小鼠模型中，通过免疫荧光验证CD24在小鼠淋巴管瓣膜的表达，验证其表达的物种保守性；使用CD24全基因敲除小鼠，定量分析新生小鼠肠系膜淋巴管和成年小鼠耳皮肤的瓣膜数量，分析淋巴引流功能，明确CD24的功能。结果解读：流式细胞术显示，人皮肤LYVE-1低表达淋巴内皮细胞（包含瓣膜细胞）中CD24阳性细胞比例显著高于LYVE-1高表达细胞（n=3，P<0.05），免疫荧光证实CD24特异性表达于人皮肤淋巴管瓣膜，是非常稳定的瓣膜标记分子（图7）。在小鼠中，CD24也特异性表达于肠系膜和耳皮肤的淋巴管瓣膜，且层流剪切应力可上调小鼠淋巴结淋巴内皮细胞中Cd24的表达（n=3）。功能实验显示，CD24敲除新生小鼠肠系膜淋巴管中瓣膜数量显著低于野生型对照（采用混合效应模型分析，P<0.001），但成年小鼠耳皮肤瓣膜数量和淋巴引流功能没有显著差异，说明CD24对小鼠肠系膜淋巴管瓣膜发育是必需的，可能在发育早期参与瓣膜形成。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用基因敲除小鼠模型、流式细胞仪、活体荧光成像系统。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究鉴定的新型生物标志物是黏附分子CD24，属于细胞表面蛋白类标志物，特异性表达于人皮肤淋巴管瓣膜上游内皮细胞，可作为淋巴管瓣膜的特异性标记分子用于相关研究。其筛选验证逻辑完整：首先通过单细胞转录组测序对瓣膜淋巴内皮细胞亚群进行亚聚类分析，筛选得到亚群特异性差异表达基因CD24，随后通过免疫荧光成像验证其在瓣膜上游的特异性定位，再通过流式细胞术验证其在瓣膜细胞中的富集，最后在小鼠模型中验证其表达的保守性和生物学功能。

研究过程中，CD24的差异来源于人皮肤淋巴内皮细胞的单细胞转录组差异分析，验证方法包括组织水平的免疫荧光染色、单细胞水平的流式细胞术定量、以及基因敲除动物模型的功能验证。特异性数据显示，CD24在LYVE-1低表达淋巴内皮细胞中的阳性比例显著高于LYVE-1高表达细胞（n=3，P<0.05），免疫荧光共定位证实其特异性定位于淋巴管瓣膜上游内皮细胞，在非瓣膜淋巴内皮细胞中几乎不表达，特异性良好。

核心成果提炼：CD24是首个被证实的流动诱导的淋巴管瓣膜上游特异性标记分子，首次明确了CD24在淋巴系统中的生物学功能，证实其参与小鼠肠系膜淋巴管瓣膜发育，CD24敲除小鼠肠系膜瓣膜数量显著减少（P<0.001）。该发现的创新性在于，首次在人皮肤淋巴管中解析出瓣膜内皮的两个功能亚群，鉴定了亚群特异性标记CD24，为淋巴管瓣膜发育研究、淋巴系统解剖学研究以及淋巴相关疾病的诊断提供了新的可靠标记分子，填补了该领域缺乏瓣膜上游特异性标记的空白。