合成的抗裂解TREM2可增强巨噬细胞吞噬作用，用于治疗炎症性疾病。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Synthetic cleavage-resistant TREM2 boosts macrophage efferocytosis to treat inflammatory diseases；

发表期刊：未明确；影响因子：未公开；研究领域：炎症性疾病免疫治疗，工程化靶向受体开发。

巨噬细胞介导的凋亡细胞清除（胞葬作用）是维持组织稳态、抑制过度炎症的核心生理过程。髓系细胞表达触发受体2（TREM2）作为细胞碎片感受器，结合凋亡细胞暴露的氨基磷脂等配体后，诱导衔接蛋白DAP12的免疫受体酪氨酸激活基序激活，启动下游信号通路促进吞噬和炎症消退。领域共识：TREM2功能受损会导致巨噬细胞吞噬能力下降，极化为促炎表型，最终造成凋亡细胞病理性累积和持续性炎症，在阿尔茨海默病、败血症、心肌梗死、代谢相关性脂肪性肝炎（MASH）、动脉粥样硬化等多种疾病中，上调TREM2都可以促进胞葬作用、减轻组织损伤、改善疾病结局，因此靶向调控巨噬细胞TREM2信号是炎症性疾病治疗的热门方向。

然而TREM2的治疗潜力受其本身易被蛋白水解切割的特性限制：炎症条件下ADAM17表达上调，会在TREM2的茎区发生切割，释放可溶性TREM2（sTREM2），破坏持续的TREM2信号，最终导致胞葬作用受损和炎症持续。目前已有研究开发出靶向TREM2茎区的激动抗体，通过阻断蛋白水解脱落来稳定膜表面受体，例如AL002和4D9，但AL002的二期临床试验因疗效有限宣告失败，说明现有基于抗体的策略存在适用性受限、功能不足的缺陷，因此亟需更精准有效的策略来解锁TREM2在炎症性疾病中的治疗潜力。本文针对天然TREM2易切割失活、现有激活策略疗效不足的核心问题，开发工程化抗切割TREM2受体，验证其增强巨噬细胞胞葬作用、缓解炎症的治疗价值，为炎症性疾病治疗提供新的技术范式。

2. 文献综述解析

作者按照“TREM2生理功能→TREM2功能障碍的分子机制→现有干预策略的进展与局限”的逻辑对现有研究进行梳理。现有研究已经明确TREM2在调控胞葬作用和炎症消退中的核心保护作用，在中枢神经退行性疾病和外周炎症疾病中均验证了TREM2激活的获益，同时明确了ADAM10/ADAM17介导TREM2切割的分子机制，建立了基因编辑模型、抗体干预、临床样本相关性分析等成熟研究方法，为后续开发新的TREM2激活策略奠定了基础。但现有研究也存在明显局限性：目前所有针对TREM2切割的干预策略都依赖抗体阻断内源性TREM2的切割，无法从根本上消除切割位点，也无法避免炎症条件下内源性受体的降解失活，临床前和临床研究显示现有抗体的治疗效果不足以满足临床需求，说明该策略无法充分发挥TREM2的治疗潜力。此外，合成受体技术通过模块化蛋白结构设计，可以精准整合配体结合功能和效应功能，实现对天然受体信号的精准调控，但该技术尚未应用于抗切割TREM2的开发，存在明确的研究空白。

本文的创新价值突出，通过对比现有研究的缺陷凸显了研究必要性：首次通过模块化工程设计，直接将TREM2的配体结合域与DAP12的胞内信号域融合，从根本上消除了ADAM17的切割位点，同时绕过了天然TREM2需要招募DAP12的激活步骤，显著增强了信号效率；其次开发了磷脂酰丝氨酸功能化的定制化脂质纳米粒递送系统，实现了CRT mRNA向病灶巨噬细胞的选择性递送，解决了mRNA靶向递送的技术难题；最后在两种MASH模型和一种动脉粥样硬化模型中验证了CRT的疗效，其治疗效果优于野生型TREM2，甚至在抗炎方面优于临床已批准药物resmetirom，为炎症性疾病治疗提供了更有效的新策略，填补了该领域的研究空白。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究框架为：研究目标是构建抗切割的工程化TREM2受体，解决天然TREM2易被炎症诱导切割失活、现有激活策略疗效不足的问题，验证其在炎症性疾病中增强巨噬细胞胞葬作用、缓解炎症的治疗效果；核心科学问题是工程化改造能否让TREM2抵抗蛋白水解切割并增强下游信号，靶向递送后能否在体内有效缓解炎症；技术路线遵循“CRT变体设计与体外筛选→巨噬细胞靶向mRNA递送系统优化→体外细胞水平功能验证→组织特异性递送系统改造→体内两种疾病模型验证疗效→安全性评价”的完整闭环逻辑。

3.1 合成抗切割TREM2变体的设计与筛选

实验目的：设计并筛选出能抵抗ADAM17切割、高效激活TREM2/DAP12信号的CRT变体。
方法细节：天然TREM2包含免疫球蛋白样结构域、柔性茎区、跨膜螺旋和短胞内尾，需要招募DAP12才能激活下游信号，ADAM17在茎区的切割会导致配体结合域丢失，功能丧失。因此本研究设计将TREM2的配体结合域通过改造的茎区和跨膜区连接到DAP12的含免疫受体酪氨酸激活基序的胞内域，共构建4种不同结构的CRT变体（I-IV型），分别在Jurkat NFAT荧光素酶报告细胞中稳定表达，以野生型TREM2联合DAP12作为阳性对照，通过流式细胞术、蛋白质印迹法验证变体的表达和成熟，然后将报告细胞与凋亡细胞共孵育，通过荧光强度检测信号激活，再用ADAM17和PMA处理验证抗切割能力，最终筛选出最优变体。
结果解读：所有CRT变体都能成功激活报告信号，除II型外，其余CRT变体的信号峰值出现更早，强度更高，其中IV型CRT在最短时间内达到最高峰值，信号强度显著高于野生型TREM2-DAP12复合物；阻断TREM2后信号呈剂量依赖性降低，证实CRT的功能依赖TREM2的免疫球蛋白样结构域。ADAM17处理后，野生型TREM2和I型CRT的信号显著降低，可溶性TREM2释放增加，而II-IV型CRT保持信号活性，没有可溶性TREM2升高，其中IV型CRT在ADAM17处理后的信号强度约为基线条件下野生型TREM2/DAP12的3.5倍（n=6，文献未明确提供P值，基于图表趋势推测具有统计学显著性）。PMA处理后，野生型和I型的全长蛋白显著降低，可溶性TREM2升高，而II-IV型没有明显变化。最终筛选出IV型CRT用于后续实验。

实验所用关键产品：文献未提及核心产品品牌信息，领域常规使用慢病毒包装系统、流式细胞仪、蛋白质印迹检测试剂、酶联免疫吸附测定试剂盒。

3.2 磷脂酰丝氨酸功能化脂质纳米粒递送系统的构建与筛选

实验目的：开发能将CRT mRNA选择性递送到巨噬细胞的递送系统，提高递送效率和生物相容性。
方法细节：基于天然氨基酸合成了以2,5-二酮哌嗪（DKP）为核心骨架的可电离脂质库，将二油酰磷脂酰丝氨酸（DOPS，即“吃我”信号，可促进巨噬细胞识别吞噬）整合到传统四组分LNP配方中，构建了150种pLNP，包裹增强绿色荧光蛋白报告基因，筛选出转染效率最高的配方，然后制备包裹CRT mRNA的CRT-pLNP，表征其物理化学性质，验证对RAW264.7细胞和原代骨髓来源巨噬细胞的递送效率。
结果解读：筛选得到含DKP-2-O的R17配方转染效率最高，RAW264.7细胞中84.5%为增强绿色荧光蛋白阳性；CRT-pLNP的包封效率为87.3%±4.6%（n=3），平均流体力学直径为114.7±5.8 nm（n=3），多分散指数为0.18±0.05（n=3），zeta电位为-3.82±1.46 mV（n=3），透射电镜显示为均一球形，平均直径约110 nm；共聚焦显微镜和流式细胞术证实，CRT-pLNP对RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞的摄取效率显著高于不含DOPS的对照LNP，平均荧光强度显著升高（n=5，P<0.05）。

实验所用关键产品：文献未提及核心产品品牌信息，领域常规使用微流控制备设备、动态光散射粒度仪、透射电子显微镜、共聚焦激光扫描显微镜。

3.3 体外验证CRT对巨噬细胞胞葬作用和炎症表型的调控

实验目的：在体外验证CRT改造后的巨噬细胞（CRT-Ms）的胞葬能力和抗炎症功能，验证其在ADAM17激活条件下的功能稳定性。
方法细节：从TREM2基因敲除小鼠分离骨髓来源巨噬细胞，用CRT-pLNP处理后，验证CRT的表达和膜定位；将巨噬细胞与棕榈酸诱导的凋亡细胞共孵育，部分巨噬细胞用白细胞介素1β预处理诱导ADAM17激活，通过共聚焦显微镜和流式细胞术定量检测胞葬效率；用蛋白质印迹法和酶联免疫吸附测定检测可溶性TREM2释放；然后用脂多糖诱导巨噬细胞极化为促炎M1表型，流式细胞术检测M1标志物CD86和M2标志物CD206的表达，酶联免疫吸附测定检测上清促炎细胞因子浓度；同时在人THP-1细胞中重复验证功能。
结果解读：CRT-pLNP可以有效将CRT mRNA递送到巨噬细胞，CRT正确定位在细胞膜上，表达稳定；TREM2基因敲除巨噬细胞的吞噬效率显著降低，表达CRT后吞噬效率显著提升，甚至超过对照野生型巨噬细胞；白细胞介素1β预处理后，对照巨噬细胞的凋亡细胞摄取显著降低，达到与TREM2敲除类似水平，而CRT-Ms的吞噬活性保持稳定；白细胞介素1β或PMA处理后，CRT-Ms的CRT蛋白水平基本不变，培养上清中几乎检测不到可溶性TREM2，而对照巨噬细胞的内源性TREM2显著降低，可溶性TREM2显著升高；脂多糖诱导后，CRT-Ms的CD86表达从62.7%±10.6%降低至30.6%±3.8%（n=5，P<0.01），CD206表达从2.5%±1.0%升高至15.8%±4.4%（n=5，P<0.01），M1/M2比值显著降低，促炎细胞因子白细胞介素6、干扰素γ、肿瘤坏死因子α的浓度显著降低（n=5，P<0.01）；在人THP-1细胞中也得到了一致的结果，证实CRT可以恢复胞葬作用，促进巨噬细胞向抗炎表型极化。

实验所用关键产品：文献提及Abcam的myc标签抗体（货号ab1394、ab18185）、碧云天的BCA蛋白定量试剂盒（货号P0012），其余为领域常规试剂。

3.4 组织特异性CRT-pLNP的改造与体内靶向效率验证

实验目的：针对MASH和动脉粥样硬化分别改造pLNP，实现病灶部位巨噬细胞的特异性靶向。
方法细节：对于MASH的肝脏靶向，在CRT-pLNP表面通过活性氧响应连接键连接可溶性Pirb（sPirb），sPirb可以结合MASH肝脏高表达的ANGPTL8，实现肝脏优先富集，炎症微环境中活性氧切割连接键，暴露DOPS实现巨噬细胞靶向；对于动脉粥样硬化，在pLNP表面修饰整合素结合肽cRGDfk，结合动脉粥样硬化斑块高表达的αvβ3整合素，促进纳米粒穿透内皮进入斑块。然后分别在MASH模型小鼠和动脉粥样硬化模型小鼠中验证靶向效率和CRT表达。
结果解读：对于肝脏靶向的CRT-sPirb/pLNPs，活性氧处理后纳米粒尺寸和zeta电位恢复基线，证实连接键可以响应活性氧断裂；MASH模型小鼠中，sPirb修饰组肝脏荧光素酶表达显著高于未修饰组，脾脏荧光显著降低，重复给药可以持续维持较高的mRNA表达；流式和免疫荧光证实，DOPS和sPirb联合作用可以实现MASH小鼠肝脏巨噬细胞的高效编辑，包括驻留巨噬细胞和炎症招募的单核来源巨噬细胞都可以有效表达CRT。对于动脉粥样硬化靶向的CRT-cRGDfk/pLNPs，修饰后纳米粒保持合适的尺寸、zeta电位和均一形态；模型小鼠中，cRGDfk修饰组主动脉荧光素表达显著提高，DOPS促进CRT与巨噬细胞的共定位，cRGDfk显著提高主动脉整体CRT表达，实现动脉粥样硬化斑块巨噬细胞的选择性靶向。
实验所用关键产品：文献未提及具体产品信息，领域常规使用活体成像系统、流式细胞仪。

3.5 HFMCD诱导MASH模型小鼠的治疗效果验证

实验目的：在HFMCD诱导的MASH小鼠模型中验证CRT的治疗效果。
方法细节：给C57BL/6小鼠饲喂高脂低蛋氨酸胆碱（HFMCD）饮食8周构建MASH模型，分为PBS对照组、野生型TREM2-sPirb/pLNPs组、CRT-sPirb/pLNPs组，尾静脉注射给药，每周两次，连续4周；通过免疫荧光检测胞葬作用和血清可溶性TREM2水平，组织染色评估肝脏脂肪变性、纤维化和凋亡细胞累积，流式细胞术检测巨噬细胞表型，酶联免疫吸附测定检测血清促炎细胞因子水平，同时评估安全性。
结果解读：治疗2周后，CRT-sPirb/pLNPs组巨噬细胞与凋亡细胞共定位比例约为对照组的3倍（n=5，P<0.01），血清可溶性TREM2水平与PBS对照组相当，而野生型TREM2组血清可溶性TREM2显著升高，证实CRT在体内炎症条件下保持抗切割特性；治疗4周后，CRT组油红O染色阳性面积、α平滑肌肌动蛋白阳性面积显著降低，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肝脏羟脯氨酸水平显著下降，凋亡细胞数量约为对照组的1/6（n=5，P<0.001）；流式显示CRT治疗后CD86表达下调，CD206表达上调，M1/M2比值显著降低，血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6水平显著降低（n=5，P<0.01）；野生型TREM2组的治疗效果弱于CRT组；安全性评价显示CRT治疗不会引起健康小鼠的器官形态、体重、血清生化和血常规异常，没有明显毒性。

实验所用关键产品：领域常规使用组织染色试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒。

3.6 HFD-CCl4诱导MASH模型小鼠的治疗效果验证

实验目的：在另一种伴明显肝纤维化的MASH模型（高脂饮食联合CCl4诱导）中验证CRT的疗效，并与临床批准药物resmetirom头对头比较。
方法细节：小鼠饲喂高脂饮食12周，联合CCl4注射4周构建MASH模型，分为PBS组、野生型TREM2组、resmetirom组、CRT组，给药方案同前，通过组织染色评估NAS评分、脂肪变性、纤维化和凋亡，分子生物学检测纤维化、脂质代谢、炎症相关基因和蛋白表达，流式分析肝脏巨噬细胞亚群和中性粒细胞浸润。
结果解读：所有治疗组都可以降低NAS评分，resmetirom和CRT都可以改善脂肪变性、炎症和肝细胞气球样变，野生型TREM2组仅减轻炎症和气球样变，对脂肪变性作用有限；胶原染色显示所有治疗组都减少纤维化沉积，CRT和resmetirom的纤维化减轻效果相当，优于野生型TREM2；CRT组凋亡细胞减少最显著，纤维化相关蛋白α-SMA、COL1A1，脂质代谢相关SCD1，促炎细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的降低程度与resmetirom相当甚至更高，对促炎细胞因子表达的抑制显著优于resmetirom（n=8，P<0.05）；CRT组单核来源巨噬细胞和中性粒细胞的浸润减少最显著，证实可以有效缓解肝脏炎症。

实验所用关键产品：领域常规使用实时定量PCR、蛋白质印迹检测试剂。

3.7 动脉粥样硬化模型小鼠的治疗效果验证

实验目的：在LDLr敲除小鼠诱导的动脉粥样硬化模型中验证CRT的治疗效果。
方法细节：LDLr敲除小鼠饲喂高脂饮食12周构建动脉粥样硬化模型，尾静脉给药每周两次，连续4周，分为PBS组、野生型TREM2-cRGDfk/pLNPs组、CRT-cRGDfk/pLNPs组；免疫荧光检测斑块内胞葬作用，组织染色检测斑块面积、坏死核心大小、纤维帽厚度和凋亡细胞数量，酶联免疫吸附测定检测血清促炎细胞因子，同时评估安全性。
结果解读：治疗2周后，CRT组巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬比例显著高于对照组和野生型TREM2组；治疗4周后，CRT组主动脉弓和头臂干的斑块面积显著减小，主动脉根部斑块面积没有明显变化；CRT组坏死核心面积占斑块面积的比例显著降低，纤维帽面积占比显著升高，斑块内凋亡细胞比例降低约5倍（n=5，P<0.01），斑块和血清中促炎细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的水平显著降低（n=5，P<0.01）；野生型TREM2组仅能轻度减少凋亡细胞累积，稳定斑块，无法有效缓解斑块内炎症；安全性评价显示CRT治疗没有明显的全身毒性。

实验所用关键产品：领域常规使用组织病理学检测试剂。

4. Biomarker研究及发现成果

本文涉及的核心生物标志物为可溶性TREM2（sTREM2），同时验证了促炎细胞因子作为疗效评价标志物的应用价值。可溶性TREM2作为反映TREM2切割水平的生物标志物，筛选验证逻辑为：基于已有的研究结论，炎症条件下天然TREM2被ADAM17切割后释放sTREM2进入循环，因此sTREM2水平可以反映TREM2的切割程度，本文通过酶联免疫吸附定量检测sTREM2水平，从细胞和体内层面验证CRT的抗切割效果。sTREM2的来源为细胞培养上清和小鼠外周血清，验证方法为酶联免疫吸附定量检测，具体数据：在体外经ADAM17或PMA处理后，野生型TREM2组细胞上清sTREM2水平显著升高，CRT组sTREM2水平无明显变化（n=6，P<0.01）；在HFMCD诱导的MASH小鼠体内，治疗2周后，野生型TREM2组血清sTREM2水平显著高于PBS对照组，CRT组血清sTREM2水平与PBS对照组无显著差异，证实CRT在体内炎症环境下可以抵抗切割，不释放sTREM2。

除sTREM2外，促炎细胞因子（肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6）作为反映炎症活动度的疗效标志物，本文验证CRT治疗后，上述促炎细胞因子在MASH和动脉粥样硬化模型的血清/组织中水平显著降低，降幅达到30%-60%（样本量n=5-8，P<0.05），证实CRT治疗可以有效缓解炎症。

本文的核心创新性成果：首次在体内验证了工程化抗切割CRT不会增加循环sTREM2水平，明确sTREM2可以作为评估TREM2抗切割治疗效果的有效生物标志物；证实CRT通过维持膜结合TREM2信号，增强巨噬细胞胞葬作用，降低炎症水平，其治疗效果优于野生型TREM2和现有临床药物，为炎症性疾病的治疗提供了新的靶点和策略，也为相关疾病的疗效监测提供了可靠的生物标志物。