c-JUN增强CRISPR敲入抗B7-H3 CAR T细胞在小细胞肺癌和胸腔SMARCA4缺陷型未分化肿瘤中的功能

1. 领域背景与文献

文献英文标题：c-JUN enhances CRISPR knockin anti-B7-H3 CAR T cell function in small cell lung cancer and thoracic SMARCA4-deficient undifferentiated tumors。

发表期刊：未明确；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤免疫治疗，CAR-T细胞治疗。

小细胞肺癌（SCLC）占所有肺癌病例的10%~15%，尽管初始对铂类化疗有响应，但超过90%的广泛期患者会在治疗后2年内复发。近年来靶向PD1的免疫检查点抑制剂已经获批用于小细胞肺癌治疗，但疗效仍然不佳。领域共识：小细胞肺癌低表达抗原加工递呈所需的TAP和B2M，使得肿瘤细胞能够逃避T细胞受体介导的T细胞攻击，这是免疫检查点抑制剂临床活性有限的核心原因。嵌合抗原受体（CAR）T细胞可以不依赖T细胞受体的方式杀伤肿瘤细胞，是小细胞肺癌治疗的潜在新方向，但目前已报道的小细胞肺癌CAR靶点数量有限，仅局限于CD56和DLL3，且二者主要表达于神经内分泌型小细胞肺癌，无法覆盖所有亚型。肿瘤内异质性是小细胞肺癌耐药的主要驱动因素，非神经内分泌细胞会促进神经内分泌亚群生长进而增强化疗耐药，因此迫切需要开发表达于小细胞肺癌各亚群的新型CAR靶点。此外，既往被归类为YAP1阳性非神经内分泌小细胞肺癌的部分肿瘤，近期被重新分类为胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤，这类肿瘤侵袭性强，约80%患者确诊时已经发生转移，对传统放化疗应答差，同样缺乏有效的免疫治疗手段。

传统CAR-T细胞生产需要制备符合药品生产质量管理规范（GMP）的病毒载体用于CAR转基因递送，成本高昂，且需要 extensive 生物安全检测，成为CAR-T临床应用的瓶颈。近年来，研究者已经开发出非病毒CRISPR-Cas9敲入技术制备CAR-T，选择纳米质粒DNA作为模板可以满足早期临床试验和上市后生产的产量需求，为CAR-T的规模化生产提供了新路径。当前领域存在的研究空白是：缺乏覆盖小细胞肺癌和胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤各亚型的广谱CAR靶点，同时非病毒CRISPR敲入CAR-T在这类肿瘤中的疗效有待提升，亟需新的改造策略克服肿瘤微环境的免疫抑制和T细胞耗竭。本研究针对这一核心问题，开发共表达AP-1转录因子c-JUN的非病毒CRISPR敲入抗B7-H3 CAR-T，探索其在小细胞肺癌和胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤中的治疗效果，为这类难治性肿瘤提供新的可转化治疗方案。

2. 文献综述解析

作者从疾病治疗现状、CAR靶点开发、CAR-T生产技术三个维度对现有研究进行梳理。在疾病治疗层面，现有研究证实小细胞肺癌对免疫检查点抑制剂应答不佳，传统化疗复发率高，胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤作为新分类的疾病，现有临床数据少，缺乏有效治疗手段；在CAR靶点开发层面，现有小细胞肺癌CAR-T研究仅聚焦于CD56和DLL3两个靶点，两个靶点均只在神经内分泌亚型表达，无法覆盖异质性小细胞肺癌的所有亚群，不能解决异质性介导的耐药问题；在CAR-T生产技术层面，传统病毒载体生产存在成本高、生物安全要求严格的瓶颈，限制了CAR-T的广泛应用，非病毒CRISPR敲入技术作为替代方案，已经被多项研究证实可以制备功能性CAR-T，利用纳米质粒DNA作为模板可以满足临床级生产的产量需求，但大插入片段CRISPR敲入的效率以及临床规模生产的可行性还有待验证。此外，已有研究证实c-JUN可以挽救CAR-T免于耗竭，增强抗原低表达肿瘤的杀伤效果，但既往研究均通过病毒载体实现c-JUN过表达，无法精准控制基因剂量，非病毒定点插入单拷贝c-JUN能否增强CAR-T功能尚未得到验证。

相较于现有研究，本研究的创新价值体现在三个方面：首次系统证实B7-H3在小细胞肺癌和胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤的所有亚型中广泛稳定表达，满足CAR-T杀伤所需的抗原密度，填补了领域缺乏广谱CAR靶点的空白；首次开发非病毒CRISPR定点敲入共表达c-JUN的抗B7-H3 CAR-T，证实仅插入单拷贝c-JUN就可以有效增强CAR-T功能，克服抗原密度低和TGF-β1介导的免疫抑制，解决了病毒载体无法精准控制基因剂量的问题；首次在临床规模成功制备该CAR-T产品，证实无脱靶基因组插入，具备良好的可转化性，为后续临床应用奠定了坚实基础。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标是开发针对小细胞肺癌和胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤的新型非病毒CRISPR敲入CAR-T，明确c-JUN是否能增强抗B7-H3 CAR-T的抗肿瘤功能；核心科学问题是B7-H3是否是适合这两类肿瘤的CAR靶点，以及c-JUN能否提升CAR-T在免疫抑制微环境中的功能；技术路线遵循“靶点筛选验证→非病毒CRISPR敲入CAR-T构建→功能验证→c-JUN共插入功能验证→耐药机制探索→临床规模生产验证→基因组毒性分析”的完整研究逻辑。

3.1 B7-H3靶点表达验证

实验目的：明确B7-H3在小细胞肺癌和胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤中的表达水平及亚型分布特征。方法细节：首先分析已发表的81例原发性人小细胞肺癌样本转录组数据中11种免疫调节配体的RNA表达水平，随后采用Quantibrite流式细胞术定量检测21株人小细胞肺癌细胞系和2株胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤细胞系表面的B7-H3分子密度，进一步分析Myc驱动小鼠小细胞肺癌模型中Cd276随肿瘤进展的表达变化，以及人原发小细胞肺癌不同亚型中的B7-H3表达水平。结果解读：转录组分析显示CD276（编码B7-H3）是小细胞肺癌中表达最高的免疫调节配体之一，23株检测细胞系中22株的B7-H3表达量超过1000个分子/细胞，所有检测细胞系的中位分子密度为2966个分子/细胞（n=23），两株胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤细胞系的B7-H3表达量分别为4463个分子/细胞和11443个分子/细胞。在小鼠小细胞肺癌模型中，随着肿瘤进展，神经内分泌标志物和现有靶点Dll3、Sez6表达下降，非神经内分泌标志物表达上升，而Cd276表达始终保持稳定。人原发小细胞肺癌验证显示，B7-H3在神经内分泌和非神经内分泌亚型中均稳定表达，且在非神经内分泌亚型中的表达量显著高于DLL3和SEZ6（P<0.05，n=81）。对应结果见图1。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用转录组测序试剂、流式细胞仪开展该实验。

3.2 病毒转导B7-H3 CAR-T功能初步验证

实验目的：明确B7-H3的表达水平是否足够激活CAR-T发挥杀伤功能。方法细节：将病毒转导的抗B7-H3 CAR-T与15株小细胞肺癌细胞系和2株胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤细胞系共培养，效靶比1:1，培养24小时后通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测白细胞介素2和干扰素γ的分泌，选择10株不同B7-H3密度的细胞系通过活细胞成像观察CAR-T的杀伤效果，进一步在NJH29小细胞肺癌异种移植小鼠模型中验证体内抗肿瘤效果。结果解读：共培养24小时后，所有检测细胞系都能诱导CAR-T显著分泌白细胞介素2和干扰素γ（P<0.05，n=17），肿瘤活力检测显示B7-H3抗原密度可以预测杀伤效果，效靶比1:1时，杀伤所需的抗原密度阈值约为250-1000个分子/细胞B7-H3。体内实验显示，与对照抗CD19 CAR-T相比，B7-H3 CAR-T能够更有效地抑制肿瘤生长。文献未提及具体实验产品，领域常规使用ELISA试剂盒、活细胞成像系统开展该实验。

3.3 非病毒CRISPR敲入B7-H3 CAR-T构建与功能验证

实验目的：建立非病毒CRISPR定点敲入B7-H3 CAR-T的工艺，并验证其体外体内功能。方法细节：选择同源定向修复途径，以纳米质粒DNA作为模板，将B7-H3 CAR片段定点插入TRAC基因座，共插入突变型二氢叶酸还原酶，利用甲氨蝶呤富集成功编辑的CAR-T（CEMENT工艺），在4例独立供体T细胞中验证编辑效率、细胞活力和细胞产量，随后选择低抗原H69、高抗原NJH29（小细胞肺癌）和H841（胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤）验证体外杀伤和细胞因子分泌，进一步构建异种移植模型验证体内疗效。结果解读：同源定向修复的插入效率约为10%~15%，富集后B7-H3 CAR阳性T细胞平均富集4.5倍（n=4供体），编辑后T细胞活力从第2天的83.5%下降到第3天的50%，非富集培养第7天恢复活力，富集培养第10天恢复活力，到第14天细胞产量持续增加。体外功能实验显示，降低效靶比后，B7-H3 CAR-T对H841细胞的杀伤效率更低，白细胞介素2和干扰素γ分泌量分别比NJH29低约50%和40%（P<0.05，n=3供体），体内异种移植实验也证实H841对B7-H3 CAR-T治疗耐药。对应结果见图2。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用CRISPR-Cas9基因编辑试剂、电转仪开展该实验。

3.4 共敲入c-JUN的B7-H3 CAR-T构建与低抗原小细胞肺癌功能验证

实验目的：明确共敲入c-JUN是否能增强B7-H3 CAR-T对低抗原小细胞肺癌的杀伤功能。方法细节：构建同时包含c-JUN、P2A-B7-H3 CAR-T2A-突变型二氢叶酸还原酶的纳米质粒DNA模板，总插入片段约3.6kb，加上同源臂全长约4.4kb，利用CRISPR同源定向修复定点插入TRAC基因座，经过CEMENT富集后，在4例独立供体中验证编辑效率和细胞产量，随后在体外和低抗原H524小细胞肺癌异种移植模型中验证功能。结果解读：优化电转缓冲液后，插入效率达到21%~31.6%（n=4供体），到第14天靶细胞比电转后扩增约3倍，插入片段长度增加1kb未影响最终CAR-T计数。体外共培养实验显示，与不表达c-JUN的B7-H3 CAR-T相比，共表达c-JUN的B7-H3 CAR-T分泌白细胞介素2和干扰素γ的水平显著提升（P<0.05，n=5供体），体内实验显示，治疗后第16天肿瘤生长显著降低（P=0.027）。对应结果见图3。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用基因合成、CRISPR编辑试剂开展该实验。

3.5 临床规模生产工艺验证与表型分析

实验目的：验证非病毒CRISPR敲入c-JUN+B7-H3 CAR-T能否在临床规模制备，分析最终产品的表型特征。方法细节：对3例健康供体的白细胞分离产物进行线性放大25倍制备，使用GMP兼容的电转系统，统计插入效率、富集倍数和最终细胞产量，通过流式细胞术和质谱流式分析CAR-T的表型。结果解读：电转后1天T细胞活力显著下降，非富集培养第7天、富集培养第10天恢复活力，B7-H3 CAR平均插入效率29.6%，c-JUN+B7-H3 CAR平均插入效率26.2%，富集后CAR阳性细胞富集3~3.5倍，到第14天，成功制备得到1.2~3.5 × 10^9个CAR阳性T细胞，足够提供多个治疗剂量。表型分析显示，与不表达c-JUN的B7-H3 CAR-T相比，富集的c-JUN+B7-H3 CAR-T中效应T细胞（CCR7-/CD45RA+ TEMRA）频率显著降低（c-JUN+为17.8%，c-JUN-为34.5%，P<0.05），中心记忆T细胞和效应记忆T细胞频率升高。质谱流式显示，磷酸化c-JUN阳性细胞中，活化增殖标志物CD25、Ki67、CD69，以及T-bet、共刺激分子CD278、趋化因子受体CXCR3的表达水平显著升高（P<0.05，n=3供体），抑制性标志物CD38表达下调。对应结果见图4。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用GMP级电转设备、流式细胞仪、质谱流式平台开展该实验。

3.6 基因组毒性分析

实验目的：明确临床规模制备的最终产品是否存在脱靶插入等基因组毒性。方法细节：通过微滴数字PCR检测TRAC位点的CAR拷贝数，通过靶向位点扩增分析插入位点特异性。结果解读：微滴数字PCR显示所有样本的CAR拷贝数约为1，说明均为单等位基因插入，靶向位点扩增证实所有构建的CAR都特异性插入TRAC基因座，未检测到脱靶插入，无基因组毒性。对应结果见图5。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用微滴数字PCR试剂盒、二代测序平台开展该实验。

3.7 胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤耐药机制探索

实验目的：明确B7-H3表达相近的情况下，H841细胞对B7-H3 CAR-T耐药的原因。方法细节：通过Luminex多重细胞因子检测分析B7-H3 CAR-T敏感细胞NJH29和耐药细胞H841的分泌组，ELISA验证转化生长因子β1（TGF-β1）的分泌，随后在共培养体系中添加外源性TGF-β1或TGF-β中和抗体fresolimumab，验证TGF-β1对CAR-T杀伤的影响。结果解读：分泌组分析显示，H841细胞比NJH29细胞高分泌T细胞抑制性细胞因子TGF-β1，ELISA证实H841细胞分泌TGF-β1的水平显著高于NJH29（P<0.05，n=2次独立实验，每次三重复），H841细胞中磷酸化SMAD2/3水平也显著更高（P<0.05，n=3次独立实验）。三次重复刺激共培养实验显示，添加TGF-β1后肿瘤细胞频率升高4倍（P<0.05，n=3独立T细胞供体），添加TGF-β中和抗体后，B7-H3 CAR-T对H841的杀伤能力显著增强。对应结果见图6。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用多重细胞因子检测试剂盒、ELISA试剂盒开展该实验。

3.8 c-JUN+B7-H3 CAR-T克服耐药的功能验证

实验目的：明确共表达c-JUN能否帮助B7-H3 CAR-T克服TGF-β1介导的抑制，增强对胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤的杀伤。方法细节：在平板结合抗原刺激实验中，添加或不添加TGF-β1，检测两组CAR-T的白细胞介素2分泌，通过转录组测序分析差异表达基因，随后在体外H841共培养实验中检测细胞因子分泌，在H841和SW1271异种移植模型中验证体内抗肿瘤效果。结果解读：添加TGF-β1后，不表达c-JUN的B7-H3 CAR-T的白细胞介素2分泌显著降低（P=0.048，n=3供体），而共表达c-JUN的B7-H3 CAR-T的白细胞介素2分泌无显著差异。转录组分析显示，添加TGF-β1后，c-JUN共表达的CAR-T中IL3、IL31、IL4、IL13、IFNG等细胞因子基因的下调程度更低，同时耗竭相关转录因子NR4A2表达显著下调（P<0.05）。体外共培养显示，c-JUN共表达的B7-H3 CAR-T分泌白细胞介素2和干扰素γ的水平显著高于不表达c-JUN的CAR-T（P<0.05，n=6供体），体内H841异种移植实验显示，治疗后第15天，c-JUN共表达组肿瘤体积平均缩小40%，与对照组相比差异显著（P=0.01），SW1271异种移植模型证实，c-JUN共表达组的CAR-T在体内扩增更强，效应T细胞频率更低。对应结果见图7。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用转录组测序、流式细胞术、动物实验相关试剂开展该实验。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究涉及的核心生物标志物是B7-H3，属于肿瘤表面抗原类CAR治疗靶点标志物，筛选验证逻辑为：基于已发表的81例原发小细胞肺癌转录组数据筛选免疫调节配体→细胞系表达定量验证→小鼠模型动态表达验证→临床样本亚型分布验证→细胞和动物水平靶点功能验证。

B7-H3的验证来源包括临床原发小细胞肺癌样本转录组数据、SCLC细胞系、胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤细胞系、小鼠自发性SCLC模型，验证方法包括转录组表达分析、流式细胞术定量细胞表面分子密度。本研究获得的核心数据如下：81例原发人小细胞肺癌中，CD276是表达最高的免疫调节配体之一，23株检测细胞系中22株B7-H3表达超过1000分子/细胞，中位分子密度为2966分子/细胞（n=23），两株胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤细胞系的B7-H3表达量分别为4463分子/细胞和11443分子/细胞。在小鼠SCLC模型中，随着肿瘤进展，Cd276表达始终保持稳定，且在神经内分泌和非神经内分泌SCLC亚型中均稳定表达，在非神经内分泌亚型中的表达显著高于已报道靶点DLL3和SEZ6（P<0.05，n=81）。

核心成果：本研究首次明确B7-H3是小细胞肺癌和胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤的广谱CAR靶点，其表达不局限于单一亚型，且满足CAR-T杀伤所需的抗原密度阈值，为这类难治性肿瘤的CAR-T治疗提供了新的有效靶点。本研究同时证实，TGF-β1高分泌是胸源性SMARCA4缺失未分化肿瘤对B7-H3 CAR-T耐药的核心生物标志物，c-JUN共表达可以通过下调NR4A2、诱导1型/2型混合细胞因子谱克服TGF-β1介导的抑制，增强抗肿瘤效果，为耐药克服提供了新的生物标志物和干预靶点。