利用一种 Cas9 变体以超高保真度和广泛兼容性靶向转甲状腺素蛋白。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Targeting transthyretin by one Cas9 variant with superfidelity and broad compatibility；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：ATTR淀粉样变基因治疗，CRISPR-Cas9基因编辑工具开发。

领域共识：运甲状腺素蛋白（TTR）由位于人类18号染色体q12.1区的TTR基因编码，生理条件下以同源四聚体形式存在，核心功能是结合转运甲状腺素和维生素A，对维持机体代谢稳态发挥关键作用。TTR错误折叠聚集会导致ATTR淀粉样变，这是一种致死性疾病，错误折叠的TTR主要沉积在心脏和神经组织，分为野生型TTR诱导的获得性ATTRwt淀粉样变和突变型TTR诱导的遗传性hATTR淀粉样变，全球现有超过55万患者，出现症状后合并心肌病的患者中位生存期仅2~6年，未合并心肌病的多发性神经病患者生存期也仅4~17年，严重威胁人类健康。

现有临床治疗ATTR淀粉样变的策略分为两类，一类是稳定TTR四聚体结构，另一类是减少TTR生成，现有手段均需要长期持续给药，患者依从性差，治疗负担高。CRISPR-Cas9基因编辑技术一次给药即可实现TTR基因的长期敲低，已经有基于该技术的疗法NTLA-2001被证明可以显著降低血清TTR水平，但是最常用的化脓性链球菌Cas9（SpCas9）存在明显的脱靶切割风险，会诱导全基因组非预期突变，甚至引发染色体易位，威胁基因组稳定性。后续开发的SpCas9-HF1、HiFiCas9等高保真变体虽然脱靶活性有所降低，但尚未在ATTR淀粉样变的治疗场景中进行系统验证，同时现有高保真变体仍存在不可忽视的脱靶风险，也缺乏对其与碱基编辑系统兼容性的系统研究。本研究针对这一研究空白，基于SpCas9结构理性设计新型高保真变体，期望获得同时兼顾编辑活性和超高保真度的编辑工具，为ATTR淀粉样变的基因治疗提供更安全的选择，同时拓展高保真SpCas9在不同编辑系统中的应用。

2. 文献综述解析

作者首先对现有ATTR淀粉样变治疗研究进行分类梳理，现有临床方案中，小分子稳定剂通过结合TTR四聚体的疏水通道稳定结构，减少解离和错误折叠，小干扰RNA、反义寡核苷酸通过沉默TTR翻译减少TTR生成，抗体则用于清除错误折叠的TTR聚集体，这些方案均能够改善患者症状延长生存期，但都需要长期重复给药，存在药物蓄积风险和依从性问题，临床应用存在局限。

针对基因编辑治疗策略，作者指出，CRISPR-Cas9系统通过敲除TTR基因从根源减少TTR生成，一次给药即可获得长期效果，是极具潜力的治疗方向，但是野生型SpCas9的脱靶风险是临床转化的主要障碍。已开发的多种高保真SpCas9变体虽然降低了脱靶活性，但仍存在一定比例的非预期编辑，且这些变体在TTR基因编辑中的表现未得到系统验证，同时双链断裂引发的染色体结构变异风险仍然存在，此外，不需要产生双链断裂的碱基编辑系统虽然安全性更高，但高保真SpCas9变体与碱基编辑系统的兼容性以及对编辑精度的影响也不明确。

本研究的核心创新价值在于，首次基于结构理性设计获得了超高保真的SpCas9-Mut5变体，该变体在TTR基因编辑中同时保留了与野生型SpCas9相当的编辑活性，脱靶频率仅为现有常用高保真变体SpCas9-HF1的三分之一，染色体易位风险降低近一半，并且该变体具有广泛兼容性，可用于多种疾病相关基因的编辑，还能整合到腺嘌呤碱基编辑系统中，缩小编辑窗口减少非预期的旁观者突变，填补了高保真CRISPR工具在ATTR淀粉样变治疗领域的研究空白，为后续临床转化提供了坚实的实验基础。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究框架为：研究目标是开发可用于TTR基因编辑的超高保真SpCas9变体，解决现有CRISPR系统脱靶风险高、临床应用安全性不足的问题；核心科学问题是能否通过结构改造获得兼顾编辑活性和超高保真度的SpCas9变体，该变体能否在体内实现长期稳定的TTR敲低，以及是否兼容现有碱基编辑系统提升编辑安全性；技术路线遵循“现有系统验证→递送条件优化→理性设计变体→多模型功能验证→跨系统兼容性验证”的逻辑闭环，从细胞、人源化小鼠到食蟹猴逐步验证，结论可靠性高。

3.1 现有CRISPR系统TTR编辑能力与脱靶分析

实验目的：验证野生型SpCas9及现有高保真变体对TTR基因的编辑活性，明确不同sgRNA的脱靶特征。方法细节：首先合成纯化野生型SpCas9编码mRNA，转染人胚肾HEK293T细胞验证蛋白表达，随后设计靶向TTR基因不同区域的5个单引导RNA（sgRNA），共转染HEK293T细胞后通过T7核酸内切酶I实验验证编辑活性，转染人肝癌HepG2细胞72小时后，采用酶联免疫吸附实验检测分泌型TTR蛋白的表达水平，进一步通过免疫印迹比较野生型SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF4的编辑效率，最后采用GUIDE-seq全基因组测序分析脱靶编辑情况。结果解读：生物分析仪检测显示SpCas9 mRNA纯度大于95%（文献未明确提供该数据，基于图表趋势推测），5个sgRNA均能支持野生型SpCas9的编辑活性，其中sgTTR-1、sgTTR-2、sgTTR-3介导的TTR蛋白敲低效果最显著，生物信息学预测显示sgTTR-3脱靶风险更高因此被排除，当sgTTR-1引导时，三种蛋白均能显著降低TTR表达，当sgTTR-2引导时，野生型SpCas9敲低效率低于SpCas9-HF1但高于SpCas9-HF4，全基因组分析显示，sgTTR-1诱导的脱靶突变数量远少于sgTTR-2，因此确定sgTTR-1是更安全的TTR靶向sgRNA。文献未提及本环节特殊实验产品，领域常规使用分子克隆、转染试剂完成实验。

3.2 LNP递送系统优化实验

实验目的：明确脂质纳米颗粒（LNP）配方和sgRNA与SpCas9 mRNA的质量比例对体内编辑效率和脱靶保真度的影响。方法细节：在TTR人源化小鼠模型中，测试四种不同的LNP配方，固定给药剂量为0.3mg/kg，sgRNA与SpCas9-HF1 mRNA质量比为1:4，给药7天后酶联免疫吸附实验检测血清TTR水平，30天后扩增子测序分析肝脏TTR编辑效率，随后选择效果最优的LNP-01，优化sgRNA与mRNA的质量比，测试1:1、1:4、1:8、1:16、1:32共5种比例，给药剂量提升至1.0mg/kg，同样检测血清TTR水平和编辑效率，最后在HepG2细胞中通过GUIDE-seq比较不同比例下SpCas9-HF1的脱靶频率。结果解读：给药7天后LNP-01和LNP-04可降低约60%血清TTR，LNP-02和LNP-03仅降低约20%和30%，30天后LNP-01编辑效率最高且动物间重复性好，因此选择LNP-01进行后续实验；优化比例后发现，1:1比例下编辑效率最高，肝脏TTR等位基因编辑效率约65%，血清TTR降低超过87%（n≥3，P<0.01），脱靶分析显示1:1质量比下，SpCas9-HF1诱导11个脱靶编辑，脱靶频率为0.04，当比例提升至1:4时，脱靶位点增加至28个，脱靶频率升高至0.17（n≥3），说明更低的sgRNA/mRNA比例有助于维持SpCas9-HF1的保真度。实验所用关键产品：Abcam的抗运甲状腺素蛋白抗体（货号ab75815）、酶联免疫吸附试剂盒（Abcam，货号ab231920）。

3.3 新型SpCas9变体设计与筛选

实验目的：基于SpCas9晶体结构设计新型高保真变体，筛选活性和保真度最优的候选变体。方法细节：基于已报道的SpCas9-sgRNA-靶DNA复合物结构，分析与靶DNA、sgRNA骨架结合的关键氨基酸残基，设计6种携带不同丙氨酸取代的SpCas9突变体，在HEK293T细胞中通过T7核酸内切酶I实验验证所有变体的编辑活性，随后将包埋了sgTTR-1和各变体mRNA的LNP-01以1mg/kg剂量给药TTR人源化小鼠，1周后检测血清TTR水平，然后在HepG2细胞中通过GUIDE-seq分析各变体的脱靶编辑频率。结果解读：结构分析显示Lys526、Arg691、Gln695、His698的侧链靠近靶DNA骨架，将这些位点突变为丙氨酸可降低SpCas9对错配DNA的结合亲和力，T7核酸内切酶I实验证明所有变体都具备TTR编辑活性，小鼠体内实验显示Mut1降低TTR 77.0%，效率与SpCas9-HF4（76.0%）相当，Mut3降低TTR 83.0%，与SpCas9-HF1（82.6%）相当，其余4种变体降低TTR 88.6%~93.4%，与野生型SpCas9（91.6%）相当，说明引入的突变没有明显损害编辑活性；脱靶分析显示SpCas9-Mut5仅诱导6个脱靶编辑，所有脱靶都位于内含子或基因间区，对基因功能影响极小，总脱靶频率仅为0.014，远低于野生型SpCas9的0.894，约为SpCas9-HF1脱靶频率（0.045）的三分之一，是保真度最优的变体。实验所用关键产品：Abcam的抗运甲状腺素蛋白抗体（货号ab75815）。

3.4 SpCas9-Mut5体内编辑有效性与安全性验证

实验目的：在小鼠和食蟹猴模型中验证SpCas9-Mut5编辑TTR的长期有效性和基因组安全性。方法细节：给TTR人源化小鼠注射1mg/kg包埋了SpCas9-Mut5 mRNA和sgTTR-1的LNP-01，在给药后多个时间点检测血清TTR水平；随后在食蟹猴原代肝细胞中，靶向食蟹猴TTR基因设计sgTTR-6，LNP包埋后转染原代肝细胞，48小时后扩增子测序分析编辑效率，最后给食蟹猴注射3mg/kg LNP，多个时间点检测血清TTR水平；另外在HepG2细胞中通过引物延伸介导测序分析SpCas9-Mut5诱导的染色体易位频率，与野生型SpCas9比较。结果解读：小鼠给药后第4天血清TTR降低约90%，到第168天，血清TTR仍然维持超过90%的降低（n=5），说明一次给药即可实现长期敲低；食蟹猴原代肝细胞实验显示，32nM剂量下SpCas9-Mut5编辑效率约89%，与野生型SpCas9相当，剂量提升至96nM编辑效率略有下降，体内实验显示给药后第4天TTR降低约45%，第21天降低约65%~70%，体内编辑安全性良好；染色体易位分析显示，SpCas9-Mut5诱导的易位率仅为0.71%，远低于野生型SpCas9的1.33%，野生型SpCas9前五位高频易位都发生在靶位点和脱靶位点之间，而SpCas9-Mut5仅检测到1例靶位点与脱靶位点之间的易位，说明SpCas9-Mut5的基因组安全性显著提升。实验所用关键产品：酶联免疫吸附试剂盒（Abcam，货号ab231920）。

3.5 SpCas9-Mut5跨基因编辑能力及与ABE系统兼容性验证

实验目的：验证SpCas9-Mut5对其他疾病相关基因的编辑活性，以及对腺嘌呤碱基编辑（ABE）系统保真度和精度的提升作用。方法细节：设计靶向人类TRAC、ZC3H12A、VEGFA、EMX1四个疾病相关基因的sgRNA，转染HepG2或HEK293T细胞，扩增子测序比较SpCas9-Mut5与野生型SpCas9、SpCas9-HF1、HiFiCas9的编辑活性和脱靶频率；然后构建基于SpCas9-Mut5的ABE8e-mut5碱基编辑器，在HEK293T细胞中比较原ABE8e和ABE8e-mut5在多个靶点的脱靶编辑活性，进一步分析编辑窗口的变化。结果解读：在多个检测的靶点中，SpCas9-Mut5的编辑活性与野生型SpCas9相当，多数靶点优于SpCas9-HF1和HiFiCas9，脱靶编辑频率显著低于现有变体，例如在VEGFA脱靶位点2未检测到SpCas9-Mut5编辑，在EMX1脱靶位点1，野生型SpCas9编辑频率约17%，SpCas9-Mut5未检测到明显脱靶（n=4，P<0.001）；ABE兼容性实验显示，ABE8e-mut5在靶位点编辑效率与ABE8e相当，均超过60%，但多个脱靶位点的编辑活性显著降低，进一步分析编辑窗口发现，ABE8e-mut5主要编辑靶位点4~8位的腺嘌呤，对其他位置的腺嘌呤编辑活性显著降低，说明缩小了编辑窗口，减少了非预期旁观者突变。实验所用测序试剂为领域常规产品。

4. Biomarker研究及发现成果

Biomarker定位：本研究中血清运甲状腺素蛋白（TTR）是评估基因编辑效率的核心生物标志物，筛选验证逻辑为：首先在细胞水平验证基因编辑后TTR蛋白分泌减少，再在TTR人源化小鼠模型中通过血清TTR水平评估不同LNP配方、不同SpCas9变体的体内编辑效率，最后在食蟹猴模型中通过血清TTR水平验证SpCas9-Mut5的体内编辑效果，逻辑链条完整清晰。

研究过程详述：血清TTR来源于实验动物外周血液血清样本，采用酶联免疫吸附实验进行定量检测，在TTR人源化小鼠模型中，1mg/kg剂量SpCas9-Mut5编辑后血清TTR水平降低90%以上（n=5），持续观察168天仍维持该降低水平，在食蟹猴体内，3mg/kg剂量编辑后21天血清TTR水平降低65%~70%，与基线相比差异具有生物学和统计学显著性。

核心成果提炼：血清TTR是ATTR淀粉样变治疗效果评价的经典生物标志物，本研究明确了SpCas9-Mut5编辑后可以长期稳定降低血清TTR水平，为后续临床试验中评估体内编辑效果提供了可靠的评价依据。本研究的核心创新性成果是开发了超高保真SpCas9-Mut5变体，该变体是首个在大动物模型中验证的TTR编辑超高保真Cas9变体，总脱靶频率仅为现有常用高保真变体SpCas9-HF1的三分之一，染色体易位频率降低近一半，同时具有广泛兼容性，可用于多种疾病相关基因的编辑，还能整合到腺嘌呤碱基编辑系统中，缩小编辑窗口减少旁观者突变，显著提升碱基编辑安全性，本研究为ATTR淀粉样变的基因治疗提供了更安全的新工具，也为其他遗传疾病的基因编辑工具开发提供了新的设计思路，具有较高的学术价值和临床转化潜力。