利用 CarboSenR2 进行基于活性的 CO(2) 传感，为细胞代谢提供了新的见解。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Activity-based CO2sensing using CarboSenR2 provides new insights into cellular metabolism；

发表期刊：未公开；
影响因子：未公开；
研究领域：细胞代谢，新型生物传感器开发。

二氧化碳是所有细胞都接触到的普遍存在的生理气体，主要由有氧代谢过程中丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶等关键酶催化反应生成。领域共识：氧气在生理系统中的重要性已得到广泛认知，但学界对二氧化碳在细胞功能中的作用仍知之甚少，造成这种认知差距的核心原因是长期以来缺乏合适且具有选择性的分子工具来测量细胞体系内的二氧化碳浓度。现有关于生理水平二氧化碳的数据大多基于动脉或静脉血气的系统测量，与组织或细胞水平的实际二氧化碳浓度存在较大偏差，无法反映细胞微环境的真实状态。近年基于活性检测（ABS）策略开发了针对分子二氧化碳的检测技术，该策略基于靶标分析物触发产生高选择性独特光谱信号的原理，设计合成了基于级联氮杂维蒂希反应的一系列新型二氧化碳活性传感器。CarboSenR2是其中一种二氧化碳响应荧光传感器，由吡罗丹明荧光团连接含偶氮磷嗪的二氧化碳响应氨基连接臂组成，在无二氧化碳时呈现绿色荧光，接触二氧化碳后发生氮杂维蒂希反应生成具有不同光学特性的稳定尿素基荧光产物R-Dye，呈现红色荧光，可通过双色荧光区分二氧化碳浓度。目前该ABS策略仅在体外使用外源性二氧化碳完成验证，尚未在细胞内特异性验证其检测生理浓度二氧化碳变化的效用，也未明确该传感器能否检测内源性代谢产生的二氧化碳变化。当前研究空白在于活细胞内缺乏可精准检测内源性二氧化碳生成的工具，无法解析细胞内二氧化碳的空间分布及其与细胞代谢的关联，因此本研究围绕CarboSenR2在生物体系中的应用效用展开表征，验证其作为活性传感器检测细胞内二氧化碳的可靠性，为细胞代谢与线粒体功能研究提供新的技术范式。

2. 文献综述解析

作者从技术发展脉络梳理了现有研究，将现有研究分为传统二氧化碳检测方法和新型活性传感技术两类，明确了不同方向的优势与局限性，突出本研究的必要性。

传统二氧化碳检测方法多依赖系统水平的血气分析，仅能获得整体水平的二氧化碳数据，无法实现活细胞原位检测，空间分辨率不足，难以反映细胞微环境甚至亚细胞区域的二氧化碳浓度差异，无法满足细胞代谢研究的需求。针对这一缺陷，近年开发的活性传感技术为二氧化碳检测提供了新的方向，该技术具备较高的选择性，能够特异性识别分子二氧化碳，避免其他干扰物质的影响，基于该技术开发的CarboSenR2传感器在体外实验中已经验证了对二氧化碳的响应能力，但现有研究仅停留在体外验证阶段，缺乏细胞内系统的功能表征，对传感器在细胞内的稳定性、pH敏感性、亚细胞分布以及对代谢变化的响应能力均不明确，无法直接应用于细胞代谢研究。本研究的创新价值在于首次在多种哺乳动物细胞系中系统完成了CarboSenR2的功能表征，证实其可以在生理到病理的二氧化碳浓度范围内实现特异性检测，并且能够反映细胞代谢状态和线粒体功能的变化，填补了活细胞原位二氧化碳检测工具的空白，为细胞代谢、线粒体功能异常相关研究提供了新的手段。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的研究目标是验证新型二氧化碳荧光传感器CarboSenR2在活细胞内检测二氧化碳的效用，核心科学问题是CarboSenR2能否特异性响应细胞内代谢产生的二氧化碳变化，能否区分不同细胞的代谢状态差异，技术路线遵循“传感器基本性能验证→亚细胞定位分析→多场景代谢干预验证→与传统标记物比较”的研究闭环，明确了传感器的应用范围与优势。

3.1 传感器基本性能与稳定性验证

实验目的：验证CarboSenR2对不同生理病理浓度二氧化碳的时间、剂量响应能力，以及细胞内稳定性和pH敏感性，明确传感器的基本检测特征。方法细节：采用THP-1单核细胞和C2C12小鼠成肌细胞作为实验模型，将负载CarboSenR2的细胞暴露于0.04%（环境浓度）、5%（生理浓度）、10%（病理浓度）三种二氧化碳环境中，使用流式细胞术动态检测0-120分钟内R-Dye的荧光强度变化，使用共聚焦显微镜检测不同二氧化碳浓度下的R-Dye荧光像素强度，采用液相色谱-二极管阵列-质谱联用分析负载后细胞内CarboSenR2和R-Dye的存在情况验证稳定性，在体外配制不同pH（4-9）的缓冲液，检测CarboSenR2和R-Dye的荧光强度变化，明确pH对传感器响应的影响。结果解读：流式细胞术结果显示，10%二氧化碳处理下R-Dye荧光强度显著高于5%二氧化碳处理，在60分钟和90分钟时间点差异最为显著，0.04%二氧化碳处理下120分钟内R-Dye荧光无显著升高，且0.04%与5%二氧化碳处理在所有时间点均存在显著差异（n=3，P<0.05）；共聚焦显微镜结果显示，R-Dye平均归一化像素强度随二氧化碳浓度升高呈剂量依赖性增加，与流式细胞术结果趋势一致；液相色谱-二极管阵列-质谱联用结果显示，负载CarboSenR2后2小时，细胞内仍可检测到完整的CarboSenR2，同时可检测到目标产物R-Dye，证实传感器在细胞内具有足够的稳定性，可满足1-2小时实验需求；体外pH实验结果显示，CarboSenR2的绿色荧光对pH敏感，但R-Dye荧光在pH4-9范围内均对pH不敏感，且在无二氧化碳存在时，仅改变pH无法生成R-Dye，在二氧化碳存在时，生理pH范围内R-Dye生成速率相当，仅在pH4/5时生成速率明显降低，证实R-Dye荧光可以特异性反映二氧化碳浓度，不受生理范围内pH变化的干扰。实验所用关键产品：ABclonal的PGC-1α抗体（货号A12348）、Cell Signaling的磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（Ser79）抗体（货号CST-3661S）、Lamin A/C抗体（货号CST-4777S）、Abcam的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1抗体（货号ab14705）。

3.2 亚细胞定位与共聚焦分析

实验目的：明确CarboSenR2和产物R-Dye在细胞内的分布特征，明确R-Dye富集区域与细胞器的关联，验证线粒体作为细胞内二氧化碳核心产生位点的结论。方法细节：以贴壁且自发荧光较低的C2C12小鼠成肌细胞为实验模型，负载CarboSenR2后，分别用Biotracker 405特异性标记线粒体，LysoTracker Deep Red特异性标记溶酶体，采用活细胞荧光显微镜成像，使用ImageJ软件定量分析不同荧光信号的像素重叠率，统计R-Dye与两种细胞器标记的共定位比例。结果解读：实验结果显示，CarboSenR2的绿色荧光相对均匀分布于整个细胞，细胞质和细胞核内均可见清晰荧光，而R-Dye荧光明显聚集在核周区域，形成明显的“热点”区域；定量分析结果显示，R-Dye荧光与线粒体标记的重叠率在50倍放大下为91.75%，100倍放大下为91.5%，而与溶酶体标记的重叠率仅为45.75%（50倍）和41%（100倍），差异具有统计学意义（n=4，P<0.0001），证实R-Dye主要富集于线粒体区域，直接证明线粒体是细胞内二氧化碳产生的核心位点，细胞内存在二氧化碳浓度梯度，核周线粒体富集区域存在二氧化碳“热点”。

3.3 代谢干预实验验证传感器响应特异性

实验目的：通过多种方式改变细胞代谢水平与线粒体功能，验证CarboSenR2生成的R-Dye荧光可以准确反映细胞内二氧化碳生成的变化。方法细节：本部分开展了多组代谢干预实验，首先在THP-1单核细胞中，使用不同浓度的鱼藤酮（线粒体电子传递链复合物I抑制剂）、寡霉素（复合物V抑制剂）处理1小时，流式检测R-Dye荧光强度；其次使用不同剂量的2-脱氧葡萄糖抑制糖酵解，使用丙二酸二甲酯抑制三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶活性，处理后检测R-Dye荧光、细胞增殖与活力；然后对分化成熟的C2C12肌管和未分化成肌细胞给予1小时电脉冲刺激（EPS）模拟运动，激活有氧代谢，检测R-Dye荧光变化与代谢通路激活；接着将THP-1单核细胞极化为Mφ、M1（促炎，糖酵解表型）、M2（抗炎，氧化磷酸化表型）三种不同代谢表型的巨噬细胞，分别在单独培养和共培养体系中检测R-Dye荧光；最后使用不同浓度的IMT-1（线粒体RNA聚合酶特异性抑制剂）处理THP-1细胞72小时，比较R-Dye荧光与传统线粒体功能标记物（线粒体膜电位、线粒体心磷脂含量）对线粒体功能损伤的检测灵敏度。结果解读：电子传递链抑制实验结果显示，鱼藤酮处理后R-Dye荧光呈剂量依赖性降低，纳摩尔浓度即可产生显著抑制，20μM寡霉素处理后R-Dye荧光显著降低（n=3，P<0.05），且这些化合物不直接影响R-Dye荧光，传感器负载也不影响细胞活力，证实荧光降低源于内源性二氧化碳生成减少；糖酵解和三羧酸循环抑制实验结果显示，6.125mM葡萄糖联合5mM 2-脱氧葡萄糖处理后，R-Dye荧光和细胞增殖均显著降低（n=3，P<0.05），8mM丙二酸二甲酯处理后R-Dye荧光和细胞增殖显著降低，细胞活力无显著变化（n=3，P<0.01），证实干扰上游代谢通路同样可以降低二氧化碳生成，R-Dye荧光可以准确响应这种变化；电脉冲刺激实验结果显示，EPS处理后成熟肌管和未分化成肌细胞的R-Dye荧光均显著升高（肌管n=4，P<0.01；成肌细胞n=5，P<0.001），而线粒体膜电位无显著变化，同时EPS处理后乙酰辅酶A羧化酶磷酸化水平升高，核内PGC-1α转位增加，证实有氧代谢通路激活，提示CarboSenR2检测二氧化碳生成的灵敏度高于传统的线粒体膜电位检测；巨噬细胞极化实验结果显示，以糖酵解为主的M1型巨噬细胞R-Dye荧光显著低于以氧化磷酸化为主的Mφ和M2型巨噬细胞，单独培养和共培养体系中结果一致（n=6，P<0.05），证实CarboSenR2可以区分不同代谢表型细胞的二氧化碳生成差异；线粒体转录抑制实验结果显示，IMT-1处理后，R-Dye荧光在0.6μM即可检测到显著降低（n=3，P<0.05），而线粒体膜电位仅在1.2μM和1.6μM剂量下显著降低，心磷脂含量仅在1.6μM剂量下显著降低，证实R-Dye荧光可以更早检测出线粒体功能异常，灵敏度优于传统标记物。

4. Biomarker 研究及发现成果

本研究中，基于CarboSenR2与细胞内二氧化碳反应生成的R-Dye荧光可作为反映细胞有氧代谢水平与线粒体功能的功能性标志物，该标志物的筛选验证遵循“传感器性能验证→亚细胞定位验证→多场景代谢干预验证→与传统标记物灵敏度比较”的完整逻辑链条。

该标志物来源于负载CarboSenR2的活细胞内，由传感器与内源性代谢产生的二氧化碳特异性反应生成，验证方法包括流式细胞术定量荧光强度、活细胞显微镜观察亚细胞分布，通过多种代谢抑制、激活实验验证响应特异性。性能数据显示，该标志物可以有效区分不同代谢表型的巨噬细胞，M1型与M2型巨噬细胞R-Dye荧光差异具有统计学意义（n=6，P<0.01）；在检测线粒体功能损伤时，该标志物可以在更低的抑制剂剂量下检测出异常，灵敏度显著高于传统的线粒体膜电位和心磷脂含量检测。核心成果：R-Dye荧光强度与细胞有氧代谢水平、线粒体功能呈正相关，可作为线粒体功能异常的早期检测标志物，在IMT-1诱导的线粒体损伤模型中，R-Dye荧光在0.6μM IMT-1处理时即可出现显著降低（n=3，P<0.05），而传统线粒体功能标记物此时尚未出现显著变化，提示该标志物可以更早反映细胞线粒体功能异常。本研究首次在活细胞内证实基于CarboSenR2的二氧化碳检测可以反映细胞代谢状态差异，为细胞代谢重编程、线粒体功能异常相关研究提供了新的标志物工具，拓展了细胞代谢研究的手段。