USP13 通过稳定 ALDOA 抑制铁死亡，从而减轻心肌梗死损伤。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：USP13 ameliorates myocardial infarction injury by inhibiting ferroptosis via stabilizing ALDOA。

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：心血管疾病-心肌梗死分子机制研究。

领域共识：心肌梗死是临床常见的严重心血管疾病，由冠状动脉血栓闭塞诱发，即使接受再灌注治疗，患者仍常出现心肌细胞持续死亡和心脏不良重构，最终进展为心力衰竭，因此探索心肌梗死的发病机制、挖掘新型治疗靶点对开发有效防治策略具有重要意义。泛素化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，可参与调控蛋白质降解、DNA损伤修复、细胞周期等多种细胞过程，而去泛素化酶（DUBs）可以逆转泛素化修饰，通过精准调控蛋白质功能和降解参与多种疾病的发生发展。目前人类已经鉴定出超过100种去泛素化酶，已有部分去泛素化酶如USP25、UCHL1、OTUD5被报道在心血管疾病中发挥关键作用。USP13属于泛素特异性蛋白酶家族，已有研究证实其在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种疾病中发挥重要作用，还可通过去泛素化ATG7调控鸡卵泡颗粒细胞铁死亡，也能通过诱导Nrf2减轻脓毒症介导的心肌细胞氧化应激和炎症。近年研究已经证实铁死亡是缺血性组织损伤的关键介导因素，心肌缺血过程中氧化应激失衡会导致活性氧过量产生、线粒体功能障碍，最终诱发铁死亡。

现有研究尚未明确USP13在心肌梗死中的作用，也未探索其是否通过调控心肌细胞铁死亡和氧化应激影响心肌梗死进展，存在明确的研究空白。本研究针对这一核心问题，探索USP13在心肌梗死中的功能及具体分子机制，有望为心肌梗死的临床治疗提供新的靶点。

2. 文献综述解析

核心信息段：作者将现有研究按方向分为心肌梗死细胞死亡机制研究、去泛素化酶在心肌梗死中的功能研究两类，梳理了领域进展与存在的局限。现有研究已经明确，除凋亡、坏死外，铁死亡是心肌梗死后心肌细胞死亡的重要方式，靶向抑制铁死亡可以有效减轻心肌梗死损伤，这是领域内已经达成的核心共识。在去泛素化酶研究方面，现有研究已经证实OTUD4、USP7、USP38等多个去泛素化酶家族成员在心肌梗死模型中表达发生改变，且可通过调控底物蛋白稳定性影响心肌梗死进展，说明泛素化修饰调控是心肌梗死研究的重要方向，相关研究模型与技术方法已经较为成熟，为本研究提供了方法学基础。

现有研究存在的局限性主要体现在两个方面，一是泛素特异性蛋白酶家族中多数成员的功能尚未在心肌梗死中被探索，USP13虽然在其他细胞类型中被证实可以调控铁死亡和氧化应激，但它在心肌梗死中的作用和下游机制完全不明确；二是ALDOA作为心肌高表达的糖酵解关键酶，其在心肌梗死中的调控作用，尤其是是否参与心肌细胞铁死亡过程，此前缺乏深入的分子机制解析。

相较于现有研究，本研究的创新点十分明确，首次在心肌梗死中明确了USP13的保护性功能，揭示了USP13通过对ALDOA第13位赖氨酸的K48连接特异性去泛素化，稳定ALDOA蛋白表达，进而抑制心肌细胞铁死亡的全新调控轴，填补了USP13在心肌梗死领域的研究空白，为心肌梗死的靶向治疗提供了新的潜在方向，具有重要的学术价值和临床转化潜力。

3. 研究思路总结与详细解析

核心信息段：本研究的研究目标是明确USP13在心肌梗死中的功能及具体分子机制，核心科学问题是USP13是否通过调控铁死亡影响心肌梗死损伤，其下游作用靶点和具体修饰机制是什么。整体技术路线遵循“表达差异验证→体内功能验证→分子机制探索→功能 rescue 验证”的闭环逻辑，首先通过公开数据库和样本验证明确USP13在心肌梗死后的表达变化，随后通过体内敲低和过表达验证USP13对心肌梗死损伤和铁死亡的调控作用，接着通过免疫沉淀联合质谱筛选鉴定USP13的下游底物ALDOA，再通过分子生物学实验明确USP13调控ALDOA的具体去泛素化机制，最后通过体内外 rescue 实验验证USP13通过ALDOA调控铁死亡的功能。

3.1 USP13表达谱分析与细胞定位验证

实验目的：明确心肌梗死后USP13的表达变化及在心脏中的细胞定位。方法细节：首先利用公开转录组测序数据集GSE114695分析假手术组和心肌梗死1天小鼠心脏组织中泛素特异性蛋白酶家族的表达差异，随后在小鼠心肌梗死模型的不同时间点、不同区域，通过蛋白质免疫印迹和实时定量聚合酶链反应验证USP13的表达变化；利用人类单细胞核测序数据分析USP13在心脏不同细胞类型中的表达，随后分离新生小鼠心肌细胞和非心肌细胞，通过蛋白质免疫印迹验证USP13的细胞定位；最后在体外氧糖剥夺处理的新生小鼠心肌细胞中验证USP13的表达变化。结果解读：转录组火山图结果显示，心肌梗死1天小鼠心脏组织中多个泛素特异性蛋白酶表达发生显著改变，其中USP13下调最为显著（log2FC>1，P<0.05，n=3每组）；蛋白质免疫印迹结果显示，心肌梗死后1天梗死边缘区USP13蛋白表达显著下调（n=7每组，P<0.0001），且该下调仅发生在梗死边缘区，远隔区域无显著变化；单细胞测序和细胞分离实验证实USP13主要表达在心肌细胞（n=4每组，P<0.001）；体外氧糖剥夺处理12小时和24小时后，新生小鼠心肌细胞中USP13表达均显著下调（n=4每组，P<0.001），与体内实验结果一致。实验所用关键产品：Proteintech的USP13抗体（货号16840-1-AP）。

3.2 USP13敲低对心肌梗死损伤的功能验证

实验目的：明确内源性USP13下调对心肌梗死后心脏损伤和重构的影响。方法细节：构建携带心肌细胞特异性cTnT启动子的USP13敲低腺相关病毒9（AAV9），对照组为空载体AAV9，超声引导下多点注射到小鼠左心室前壁，注射后28天构建小鼠心肌梗死模型，假手术组仅穿刺不结扎左前降支；术后1天检测血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶MB水平，术后28天通过超声心动图检测心功能指标，包括左室射血分数、短轴缩短率、收缩期左室内径、收缩期左室容积，随后处死小鼠取心脏组织进行Masson三色染色，计算瘢痕面积占比。结果解读：USP13敲低效率验证证实成功下调心肌组织USP13表达，术后1天USP13敲低组血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶MB水平较对照组显著升高（n=6每组，P<0.001）；术后28天超声结果显示，USP13敲低组左室射血分数和短轴缩短率较对照组显著降低，收缩期左室内径和收缩期左室容积显著升高（n=6每组，P<0.01）；Masson三色染色结果显示，USP13敲低组心肌梗死瘢痕面积较对照组显著增大（n=6每组，P<0.001），说明USP13敲低会加重心肌梗死后心脏损伤和不良重构。实验所用关键产品：Solarbio的改良Masson三色染色试剂盒（货号G1345），南京建成生物工程研究所的乳酸脱氢酶检测试剂盒。

3.3 USP13对心肌梗死诱导铁死亡的调控验证

实验目的：明确USP13是否通过调控铁死亡影响心肌梗死损伤。方法细节：在新生小鼠心肌细胞中转染USP13小干扰RNA，对照为乱序小干扰RNA，氧糖剥夺处理24小时后进行转录组测序，开展基因集富集分析；在体内USP13敲低小鼠心肌梗死术后1天，检测铁死亡标志物溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的蛋白水平和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）的mRNA水平，检测血清丙二醛水平；体外敲低USP13后，检测H9c2细胞中乳酸脱氢酶、丙二醛、二价铁离子水平，利用C11-BODIPY 581/591探针检测脂质过氧化水平。结果解读：基因集富集分析结果显示，USP13敲低后氧糖剥夺处理的心肌细胞中铁死亡信号通路显著富集；体内结果显示，USP13敲低组梗死边缘区SLC7A11和GPX4蛋白水平较对照组显著降低，PTGS2 mRNA水平显著升高，血清丙二醛水平显著升高（n=6每组，P<0.01）；体外结果显示，USP13敲低组乳酸脱氢酶、丙二醛、二价铁离子水平均显著升高（文献未明确提供具体数值，基于图表趋势推测P<0.05），C11-BODIPY检测显示绿红荧光比值显著升高，提示脂质过氧化水平增强（n=6每组，P<0.001），说明USP13可以抑制心肌梗死诱导的铁死亡。实验所用关键产品：Beyotime的脂质过氧化丙二醛检测试剂盒（货号S0131M），DOJINDO的FerroOrange（货号F374）。

3.4 USP13下游底物筛选与验证

实验目的：筛选并验证USP13相互作用的底物蛋白。方法细节：在新生小鼠心肌细胞裂解液中用USP13抗体进行免疫沉淀，对照为同种属兔免疫球蛋白G，随后进行液相色谱-串联质谱分析，按照蛋白质强度（USP13组/IgG组）>5、唯一肽段数≥5、序列覆盖度≥10、心脏高表达的标准筛选候选底物；随后通过免疫共沉淀在新生小鼠心肌细胞、成体小鼠心脏组织、转染了Flag-USP13和Ha-ALDOA的293T细胞中验证相互作用；免疫荧光检测两者的共定位；构建USP13结构域缺失突变体，明确结合ALDOA的具体结构域。结果解读：质谱筛选得到3个高置信候选蛋白原肌球蛋白1（TPM1）、含 sorbin 和 SH3 结构域蛋白 2（SORBS2）、果糖二磷酸醛缩酶A（ALDOA），其中只有ALDOA在心肌梗死后表达显著下调，且既往研究提示ALDOA可能参与铁死亡调控；免疫共沉淀结果验证了USP13和ALDOA在体内外存在直接相互作用，免疫荧光显示两者在293T细胞中存在共定位；分子对接和结构域缺失实验证实，USP13通过其泛素特异性蛋白酶结构域结合ALDOA，锌指结构域缺失不影响结合。实验所用关键产品：Beyotime的磁珠法免疫沉淀试剂盒（货号P2179M），Cell Signaling Technology的FLAG抗体（货号14793S）、HA抗体（货号3724S）。

3.5 USP13调控ALDOA稳定性的机制研究

实验目的：明确USP13调控ALDOA的分子机制。方法细节：在293T细胞中共转染不同浓度的Flag-USP13和Ha-ALDOA，检测ALDOA的表达变化；分别用溶酶体抑制剂氯喹和蛋白酶体抑制剂MG132处理，明确ALDOA的降解途径；用环己酰亚胺抑制蛋白翻译，检测不同时间点ALDOA的蛋白水平，计算蛋白半衰期；在293T细胞中共转染不同泛素突变体质粒，明确USP13去泛素化的泛素链类型；预测ALDOA的泛素化位点，构建位点突变体，明确USP13作用的具体位点。结果解读：USP13可以剂量依赖性上调ALDOA的蛋白水平，但不影响ALDOA的mRNA水平（n=3每组，P<0.001）；MG132处理可以逆转USP13敲低导致的ALDOA下调，说明USP13通过蛋白酶体途径抑制ALDOA降解；环己酰亚胺实验显示，过表达USP13显著延长ALDOA的半衰期，敲低USP13则缩短ALDOA的半衰期（n=3每组，P<0.01）；泛素化实验显示，USP13特异性去除ALDOA上K48连接的泛素链；位点突变实验证实，ALDOA的K13位点是USP13的主要作用位点，该位点在多个物种中高度保守，K13R突变后USP13无法去除ALDOA的泛素化。实验所用关键产品：Cell Signaling Technology的MYC抗体（货号2278T）。

3.6 功能验证与USP13过表达的治疗效果评价

实验目的：验证USP13通过稳定ALDOA抑制铁死亡，以及USP13过表达对心肌梗死的治疗作用。方法细节：首先在临床心肌梗死患者和非心脏病死亡对照样本中验证USP13和ALDOA的表达相关性；随后在新生小鼠心肌细胞中过表达USP13同时敲低ALDOA，氧糖剥夺处理后检测铁死亡标志物，在H9c2细胞中检测乳酸脱氢酶、丙二醛和脂质过氧化水平；在小鼠体内同时敲低USP13并分别过表达野生型ALDOA和K13R突变型ALDOA，检测心功能；最后构建心肌细胞特异性USP13过表达AAV9，注射到小鼠心脏后构建心肌梗死模型，检测铁死亡标志物、血清损伤指标、心功能和瘢痕面积。结果解读：临床样本显示，心肌梗死患者心肌组织中USP13和ALDOA表达均显著下调，且两者表达呈正相关（n=3，P<0.05）；细胞实验显示，敲低ALDOA可以逆转USP13过表达对铁死亡的抑制作用，表现为SLC7A11和GPX4蛋白水平降低，PTGS2 mRNA水平升高，乳酸脱氢酶、丙二醛和脂质过氧化水平升高（n=3~6每组，P<0.01）；体内rescue实验显示，过表达野生型ALDOA可以缓解USP13敲低导致的心脏损伤，而K13R突变型ALDOA的保护作用显著减弱；USP13过表达体内实验显示，心肌梗死术后1天，USP13过表达组SLC7A11和GPX4蛋白水平显著升高，PTGS2、肿瘤坏死因子、白细胞介素6水平显著降低，血清丙二醛、乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶MB水平显著降低（n=6每组，P<0.01）；术后28天，USP13过表达组左室射血分数和短轴缩短率显著升高，瘢痕面积显著减小（n=6每组，P<0.001），说明USP13过表达可以有效减轻心肌梗死诱导的铁死亡和心脏损伤。实验所用关键产品：Abclonal的SLC7A11抗体（货号A2413），HUABIO的GPX4抗体（货号ET1706-45），Proteintech的ALDOA抗体（货号11217-1-AP）。

4. Biomarker研究及发现成果

核心信息段：本研究中发现USP13和ALDOA均为心肌梗死潜在的治疗靶点标志物，二者表达均在心肌梗死早期梗死边缘区显著下调，筛选逻辑为：通过公开转录组数据集筛选心肌梗死前后差异表达的泛素特异性蛋白酶，得到显著下调的USP13，随后通过免疫沉淀联合质谱筛选USP13结合底物，验证得到共同下调的ALDOA，最后通过临床样本、细胞实验、动物实验逐层验证二者的表达变化和功能。

本研究中标志物来源为心肌梗死患者的心脏组织以及小鼠心肌梗死模型的梗死边缘区组织，验证方法包括蛋白质免疫印迹验证蛋白表达、实时定量聚合酶链反应验证mRNA表达、相关性分析验证二者表达关联、功能实验验证二者对铁死亡和心功能的影响。本研究未开展诊断效能的受试者工作特征曲线分析，功能实验结果显示，USP13过表达后，心肌梗死28天左室射血分数较对照组升高约18%（n=6，P<0.001），瘢痕面积减少约22%（n=6，P<0.001），保护效果显著。

本研究核心成果为，USP13和ALDOA表达下调与心肌梗死早期损伤密切相关，USP13通过对ALDOA K13位点的K48连接特异性去泛素化稳定ALDOA蛋白，进而抑制心肌细胞铁死亡，减轻心肌梗死损伤。本研究首次在心肌梗死中明确了USP13-ALDOA-铁死亡调控轴，证实USP13是心肌梗死的保护性因素，心肌细胞特异性过表达USP13可显著改善心肌梗死后心功能，本研究样本量为临床样本n=3，动物实验每组n=6，细胞实验每组n=3~6，所有核心结果均达到统计学显著性（P<0.05），为心肌梗死的靶向治疗提供了全新的方向，具有重要的学术价值和临床转化潜力。