超低输入 rG4-seq 揭示了 RNA G-四链体调控组在基因表达和基因组完整性中的作用。
Ultra-low-input rG4-seq reveals the RNA G-quadruplex regulome in gene expression and genome integrity.
1. 领域背景与文献
发表期刊：Nucleic Acids Research；影响因子：14.901；研究领域：RNA结构生物学、发育生物学、生殖生物学
RNA二级结构是基因表达调控的关键元件，其中RNA G-四链体（rG4）是由富含鸟嘌呤的序列形成的动态二级结构，参与转录、剪接、翻译、mRNA稳定性等多个基因表达调控过程。然而，现有rG4检测技术（如rG4-seq、DMS probing）需要大量细胞输入（百万级），难以在稀有细胞类型（如卵母细胞）中研究rG4在生理条件下的动态调控，限制了对rG4体内生理功能的认识。作为rG4解旋酶的DHX36，其功能存在矛盾报道，部分研究认为它解旋rG4，部分研究显示它可能稳定rG4，且其在发育过程中的作用尚未阐明。卵母细胞作为体内最大的细胞，储存大量母源mRNA，在发育过程中受到严格的转录和翻译调控，是研究RNA结构调控的理想模型，但此前缺乏适用于卵母细胞的rG4检测技术。本文针对这些研究空白，开发了超低输入量rG4测序技术（ULI-rG4-seq），并结合基因编辑和功能分析，揭示了DHX36调控rG4稳态的双重机制，以及rG4在基因表达、基因组稳定性和雌性生殖中的关键作用。
2. 文献综述解析
本文综述了rG4结构生物学领域的研究现状，指出当前研究的局限在于技术限制导致难以在稀有细胞中研究rG4的体内动态，以及对rG4调控机制尤其是DHX36的功能认识不足。
现有研究已证实rG4在多种细胞系中参与基因表达调控，通过生物信息学预测和体外实验发现rG4存在于mRNA的UTR、外显子等区域，调控翻译起始和mRNA稳定性；DHX36作为经典的rG4解旋酶，在体外实验中能高效解旋rG4，在细胞系中被报道参与调控rG4介导的翻译和mRNA稳定性，但这些研究多基于体外或细胞系，缺乏体内生理条件下的验证，尤其是在发育过程中的功能。此外，现有研究对rG4的动态调控机制认识不足，比如rG4在不同发育阶段的分布变化，以及细胞如何维持rG4稳态的机制尚未阐明。同时，DHX36的亚细胞定位存在争议，部分研究显示其在细胞核，部分显示在细胞质，其在不同细胞类型中的功能差异也未明确。
本文通过开发ULI-rG4-seq技术，首次实现了从100个细胞中检测rG4的转录组水平分布，解决了稀有细胞类型中rG4研究的技术瓶颈；首次在体内（卵母细胞）系统解析了rG4的动态分布和调控机制，发现DHX36具有双重调控作用，急性缺失导致rG4积累，慢性缺失导致rG4水平整体降低，修正了此前对DHX36仅作为rG4解旋酶的认识；揭示了rG4通过调控转录延伸因子的翻译，进而影响转录延伸、R-loop形成和基因组稳定性的全新机制，建立了RNA结构调控与基因组稳定性的关联；阐明了rG4稳态在雌性生殖中的关键作用，为生殖障碍的机制研究提供了新视角。
3. 研究思路总结与详细解析
本文以卵母细胞为模型，通过技术开发（ULI-rG4-seq）、基因编辑（DHX36条件敲除、敲入）、功能分析（Trim-away、报告基因系统、多组学分析）等手段，系统解析了rG4的动态调控机制及其在基因表达、基因组稳定性和雌性生殖中的功能，研究路线遵循“技术突破→特征解析→调控因子鉴定→机制阐明→生理功能验证”的逻辑闭环。
3.1 超低输入量rG4测序（ULI-rG4-seq）技术的开发与验证
实验目的：开发适用于稀有细胞类型的高灵敏度rG4转录组水平检测技术，突破现有技术的细胞输入量限制。
方法细节：整合cPDS（rG4稳定剂）处理、甲醛交联、FLAG-BG4抗体富集rG4结构，结合文库构建技术，实现从约100个卵母细胞中检测rG4；用QUMA-1荧光探针染色验证rG4的存在和cPDS的稳定作用，用圆二色谱（CD）验证rG4的二级结构，通过生物重复验证技术的重复性。
结果解读：ULI-rG4-seq在生物重复间具有高重复性（Pearson相关系数R>0.8），能检测到rG4的动态变化，cPDS处理后检测到的rG4峰数量从19844增加到94879，表明该技术能捕获稳定和动态的rG4结构； motif分析显示富集经典的G4基序（G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3），CD光谱验证了4个候选基因（Ybx2、Ccnt1、Tcea1、Zar1l）的rG4结构为平行型，跨物种保守性分析显示88%的rG4峰能映射到人类基因组，表明rG4结构具有进化保守性。
产品关联：实验所用关键产品：cPDS（Sigma–Aldrich）、QUMA-1（MerckMillipore, SCT056）、BG4抗体、Chirascan分光光度计（Applied Photophysics）、Illumina测序平台。
3.2 卵母细胞中rG4的转录组水平分布特征解析
实验目的：解析rG4在卵母细胞转录组中的分布特征和功能关联。
方法细节：通过ULI-rG4-seq检测对照组和cPDS处理组卵母细胞的rG4分布，结合RNA-seq数据进行关联分析，通过基因本体（GO）富集分析rG4相关基因的功能。
结果解读：rG4在卵母细胞转录组中分布于mRNA的5"UTR（6.69%）、3"UTR（18.88%）、外显子（49.35%）和内含子（14.74%）区域，在转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TES）附近富集；GO分析显示rG4相关基因参与mRNA加工、染色质修饰、细胞周期调控、翻译调控等关键生物学过程，表明rG4作为结构开关协调转录和转录后调控。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用RNA-seq文库构建试剂盒、GO分析工具（如DAVID、STRING）。
3.3 DHX36的亚细胞定位与应激响应特性研究
实验目的：明确DHX36在卵母细胞中的亚细胞定位，及其在应激条件下的行为。
方法细节：通过CRISPR-Cas9技术构建DHX36-GFP-FLAG-HA敲入小鼠（Dhx36ki/ki），用免疫荧光和亚细胞组分分离分析DHX36的定位；用热休克（42°C，1h）和氧化应激（H2O2处理）处理卵母细胞，结合QUMA-1染色观察DHX36与rG4的共定位。
结果解读：DHX36在卵母细胞中主要定位于细胞质，即使在核输出抑制剂处理下仍保持细胞质定位，表明其细胞质定位是稳定的；应激条件下，DHX36与rG4共定位于细胞质应激颗粒中，表明DHX36参与应激条件下的rG4调控。
产品关联：实验所用关键产品：CRISPR-Cas9基因编辑系统、抗GFP抗体（ab290, Abcam）、抗FLAG抗体（F1804-50UG, Sigma）、亚细胞组分分离试剂盒。
3.4 DHX36与rG4互作的转录组水平调控网络解析
实验目的：系统解析DHX36与rG4的互作网络，明确DHX36的靶基因。
方法细节：用Dhx36ki/ki卵母细胞进行LACE-seq（检测RBP结合位点），结合ULI-rG4-seq数据进行整合分析，通过GO富集分析DHX36靶基因的功能。
结果解读：LACE-seq显示DHX36结合位点在TSS和TES附近富集，主要分布于外显子（45.30%）和UTR（24.77%）区域；整合分析显示3405个基因同时被DHX36结合且含有rG4，占DHX36靶基因的79%，占rG4相关基因的62%，这些基因参与RNA剪接、组蛋白修饰、转录调控等过程，表明DHX36通过结合rG4调控这些基因的表达。
产品关联：实验所用关键产品：LACE-seq文库构建试剂盒、Illumina测序平台。
3.5 DHX36敲除对rG4稳态的长期影响分析
实验目的：研究DHX36长期缺失对rG4稳态的影响。
方法细节：通过条件基因编辑构建卵母细胞特异性DHX36敲除小鼠（Dhx36fl/fl;SKO），用QUMA-1染色和ULI-rG4-seq检测rG4水平，用Western blot验证DHX36敲除效率。
结果解读：Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞中DHX36蛋白水平显著降低，QUMA-1信号强度显著降低（n=30，P<0.0001），ULI-rG4-seq显示rG4峰数量整体减少，尤其是在TSS和TES附近的rG4信号显著降低，表明长期缺失DHX36导致rG4水平整体下降，与此前认为DHX36作为rG4解旋酶的预期相反。
产品关联：实验所用关键产品：抗DHX36抗体（ab70269_50 μl, Abcam）、Western blot相关试剂（ECL底物、PVDF膜）。
3.6 Trim-away技术揭示DHX36对rG4调控的时间动态性
实验目的：研究DHX36急性缺失对rG4稳态的影响，对比长期缺失的差异。
方法细节：结合Dhx36ki/ki小鼠和Trim-away技术，将TRIM21-mCherry mRNA和抗GFP抗体显微注射到卵母细胞中，3h后检测DHX36蛋白水平和rG4水平。
结果解读：Trim-away处理3h后，DHX36蛋白水平几乎完全消失（P<0.0001），QUMA-1信号强度显著升高（n=30，P<0.0001），表明急性缺失DHX36导致rG4积累，与长期缺失的结果相反；这一发现揭示了DHX36的双重调控作用：急性缺失时，DHX36作为解旋酶的功能消失，rG4无法被解旋而积累；长期缺失时，细胞启动适应性机制，导致rG4合成减少或降解增加，整体水平下降。
产品关联：实验所用关键产品：TRIM21-mCherry mRNA、抗GFP抗体（ab6556）、显微注射系统。
3.7 rG4结构动态调控mRNA稳定性的机制解析
实验目的：解析rG4结构对mRNA稳定性的调控作用，以及DHX36在其中的功能。
方法细节：用RNA-seq分析Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞的基因表达变化，结合ULI-rG4-seq数据比较rG4相关基因和非rG4基因的表达差异；用转录抑制剂DRB处理卵母细胞，检测mRNA半衰期。
结果解读：Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞中，rG4相关基因的表达显著下调，且mRNA半衰期显著缩短（从50h降至25h），而非rG4基因的半衰期无显著变化；关键母源基因如Zar1、Zar1L的表达分别降低70%和40%（P<0.01），表明rG4结构维持mRNA稳定性，DHX36缺失导致rG4稳态失衡，进而降低rG4相关mRNA的稳定性。
产品关联：实验所用关键产品：DRB（Sigma, D1916）、RNA-seq文库构建试剂盒。
3.8 DHX36通过rG4调控翻译的机制研究
实验目的：明确rG4结构对翻译的调控作用，以及DHX36在其中的功能。
方法细节：构建rG4调控的双报告基因系统（rG4-mCherry和rG4-free EGFP），显微注射到Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞中，观察报告基因的表达；用HPG-594代谢标记检测整体翻译水平；用免疫荧光和Western blot检测内源性rG4相关基因（如Ybx2）的蛋白水平。
结果解读：双报告基因系统显示，Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞中rG4-mCherry的翻译显著降低，而rG4-free EGFP的翻译不受影响；HPG-594标记显示整体翻译水平显著降低（P<0.0001）；内源性Ybx2基因的mRNA水平升高，但蛋白水平显著降低（P<0.001），表明DHX36通过解旋rG4促进rG4相关mRNA的翻译。
产品关联：实验所用关键产品：HPG-594、抗YBX2抗体（R1510-36, HUABIO）、双报告基因载体。
3.9 rG4动态通过DHX36调控转录延伸的机制解析
实验目的：解析rG4结构对转录延伸的调控作用，以及DHX36在其中的功能。
方法细节：用EU标记检测整体转录水平，用免疫荧光和CUT&Tag检测RNA聚合酶II（Pol II）的分布和暂停指数；用cPDS处理对照卵母细胞，模拟rG4稳定的情况。
结果解读：Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞中EU标记信号显著降低（P<0.0001），表明整体转录水平下降；Pol II在TSS附近积累，暂停指数升高，cPDS处理对照卵母细胞也出现类似的Pol II积累；关键转录延伸因子CCNT1和TCEA1的蛋白水平显著降低，而mRNA水平无显著变化或升高，表明DHX36通过促进这些因子的翻译，进而调控转录延伸。
产品关联：实验所用关键产品：EU（5-ethynyl uridine）、抗Pol II抗体（39 097, Active Motif）、CUT&Tag文库构建试剂盒。
3.10 rG4稳态失衡引发R-loop介导的基因组不稳定性
实验目的：解析rG4稳态失衡对基因组稳定性的影响，以及机制。
方法细节：用抗R-loop抗体（S9.6）检测Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞的R-loop水平，用免疫荧光检测DNA损伤标记（γH2AX、53BP1）；显微注射RNaseH1 mRNA或用α-amanitin抑制转录，检测R-loop和DNA损伤的变化。
结果解读：Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞中R-loop水平显著升高（P<0.0001），γH2AX和53BP1信号显著升高，且与R-loop共定位；显微注射RNaseH1 mRNA或抑制转录后，R-loop和DNA损伤信号显著降低，表明rG4稳态失衡导致转录延伸缺陷，进而引发R-loop积累和DNA损伤。
产品关联：实验所用关键产品：抗R-loop抗体（S9.6, MABE1095, Merck Millipore）、抗γH2AX抗体（20E3, 9718S, CST）、RNaseH1 mRNA。
3.11 细胞质rG4调控对细胞核剪接事件的影响
实验目的：解析细胞质rG4调控对细胞核剪接的影响，以及DHX36在其中的功能。
方法细节：用rMATS分析Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞的可变剪接事件，结合ULI-rG4-seq和LACE-seq数据分析剪接因子的表达变化；用免疫荧光检测剪接因子SRSF9的蛋白水平。
结果解读：Dhx36fl/fl;SKO卵母细胞中可变剪接事件显著增加，其中跳过外显子（SE）事件占69.5%；剪接因子SRSF9的mRNA和蛋白水平显著降低，而SRSF9的mRNA含有rG4，被DHX36结合，表明DHX36通过调控SRSF9的翻译，进而影响细胞核的剪接过程，建立了细胞质rG4调控与细胞核剪接的跨区室关联。
产品关联：实验所用关键产品：rMATS分析工具、抗SRSF9抗体（A12538, Abclonal）。
3.12 rG4稳态对雌性生殖潜能的调控作用
实验目的：明确rG4稳态在雌性生殖中的生理功能。
方法细节：将Dhx36fl/fl;SKO雌性小鼠与野生型雄性小鼠交配，观察6个月的繁殖情况；用超排卵实验检测卵母细胞数量和成熟情况；用组织学分析卵巢卵泡数量。
结果解读：Dhx36fl/fl;SKO雌性小鼠完全不育，6个月内未产仔；超排卵实验显示，Dhx36fl/fl;SKO小鼠的排卵数显著减少，且卵母细胞停滞在GV期；组织学分析显示，Dhx36fl/fl;SKO小鼠的卵巢卵泡数量从2个月开始显著减少，7个月时几乎耗尽，表明rG4稳态失衡导致卵母细胞发育异常和卵巢早衰。
产品关联：实验所用关键产品：组织学相关试剂（H&E染色试剂盒、石蜡包埋试剂）。
4. Biomarker研究及发现成果
本文的Biomarker包括RNA G-四链体（rG4）结构本身，以及调控rG4稳态的关键因子DHX36，rG4作为基因表达调控的结构元件，其稳态失衡与基因表达异常、基因组不稳定性和生殖障碍相关；DHX36作为rG4稳态的调控因子，其功能异常导致rG4稳态失衡，进而引发一系列病理生理变化。
rG4是通过ULI-rG4-seq技术从卵母细胞中筛选得到的结构元件，筛选逻辑为：用cPDS稳定rG4，通过FLAG-BG4抗体富集rG4结构，构建测序文库，通过生物信息学分析鉴定rG4峰；验证逻辑为：用QUMA-1荧光探针染色验证rG4的存在，用圆二色谱验证rG4的二级结构，通过跨物种保守性分析验证其进化保守性；DHX36作为rG4的调控因子，通过LACE-seq技术鉴定其结合rG4的靶基因，通过基因敲除和Trim-away技术验证其对rG4稳态的调控作用。
rG4来源于卵母细胞的mRNA，通过ULI-rG4-seq检测到94879个rG4峰（cPDS处理组），其中65.6%的峰含有经典G4基序；用QUMA-1染色检测rG4的特异性，cPDS处理后信号强度显著升高（n=30，P<0.0001）；用圆二色谱验证4个候选rG4的结构，均显示K+依赖的平行型rG4特征；DHX36通过结合rG4调控其稳态，急性缺失DHX36导致rG4积累（QUMA-1信号升高，P<0.0001），慢性缺失导致rG4水平下降（QUMA-1信号降低，P<0.0001）。
rG4作为结构Biomarker，其功能关联包括调控mRNA稳定性（rG4相关mRNA半衰期在DHX36缺失时从50h降至25h）、翻译（rG4相关基因的翻译在DHX36缺失时显著降低）、转录延伸（rG4稳定导致Pol II暂停指数升高）、基因组稳定性（rG4稳态失衡导致R-loop积累和DNA损伤）；DHX36作为调控Biomarker，其创新性在于首次发现其具有双重调控rG4的作用，急性缺失促进rG4积累，慢性缺失降低rG4水平，修正了此前对DHX36仅作为rG4解旋酶的认识；rG4稳态失衡与雌性生殖障碍相关，Dhx36fl/fl;SKO雌性小鼠完全不育，卵巢早衰，表明rG4和DHX36可作为雌性生殖潜能的Biomarker；所有实验数据均有样本量和P值支持，如QUMA-1信号强度比较n=30，P<0.0001；mRNA表达差异P<0.01或P<0.001等。