氟化作用增强了基于 D 肽的放射性治疗诊断剂的肿瘤结合和抗肿瘤免疫力，可用于联合免疫检查点阻断疗法。
Fluorination augments tumor engagement and antitumor immunity of a D-peptide-based radiotheranostic agent for combinatorial immune checkpoint blockade therapy.
1. 领域背景与文献
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤核医学与PD-L1靶向放射诊疗。
领域共识：程序性死亡配体1（PD-L1）在多种恶性肿瘤中呈高表达，是抑制免疫监视的核心免疫检查点分子，PD-L1靶向放射诊疗已经成为肿瘤患者分层、治疗监测以及肿瘤治疗的有效策略。放射性药物治疗可将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，激活系统性抗肿瘤免疫，从而增强免疫检查点阻断治疗的效果，二者联合具有广阔的应用前景。
当前该领域存在的核心问题是，实现稳定的协同抗肿瘤免疫效应迫切需要具备优异体内稳定性、高肿瘤结合能力以及 prolonged 肿瘤滞留的放射性药物，但此类药物仍未得到有效开发。D肽由D型对映氨基酸构成，构型与L肽相反，具备优异的蛋白酶降解抗性，同时可保持与L肽相当的靶标结合亲和力，是理想的放射性配体载体。此前研究团队已开发出PD-L1靶向D肽放射性配体[64Cu]/[68Ga]DPA，相比多数L肽PD-L1靶向配体，其体内稳定性显著提升，可改善肿瘤-背景对比度以及药代动力学特征，初步临床研究也验证了D肽在放射性药物开发中的潜力，但是DPA的靶标结合能力不足，限制了其作为放射性治疗载体的疗效提升。氟代氨基酸取代是优化肽理化性质的成熟策略，氟代残基可在不改变天然构象的前提下稳定肽结构，增强体内稳定性、强化蛋白-配体相互作用，还可延长肽循环时间、增加细胞通透性，在放射性药物优化中具有重要应用价值。因此，本研究针对现有PD-L1靶向D肽放射性配体肿瘤结合能力不足的研究空白，通过氟修饰优化D肽性能，旨在开发更有效的PD-L1靶向放射性药物，提升放射性药物治疗联合免疫检查点阻断的抗肿瘤效果，为该领域提供新的优化策略与候选药物。
2. 文献综述解析
作者对现有研究的分类梳理逻辑围绕“PD-L1放射诊疗载体发展→D肽载体的优势与不足→氟修饰的应用价值”三个维度展开，逐步推导本研究的必要性。现有PD-L1靶向放射诊疗药物多数基于L肽开发，L肽易被体内蛋白酶降解，存在体内稳定性差、肿瘤摄取低的局限性，难以满足临床需求。针对L肽的缺陷，D肽凭借其特殊的镜像构型获得了蛋白酶降解抗性，同时可保持与L肽相当的靶标结合亲和力，成为更具潜力的放射性配体载体，现有研究包括作者团队前期工作已证实，D肽PD-L1靶向配体相比L肽体内稳定性更优，肿瘤背景对比度更高，药代动力学特征更好，初步人体正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）成像研究也验证了D肽的开发潜力，但是现有D肽配体仍存在靶标结合不足、肿瘤摄取与滞留不理想的问题，需要进一步优化。针对氟代氨基酸修饰的现有研究证实，该策略可在最小程度破坏天然构象的前提下稳定肽结构，氟作为强氢键受体可稳定蛋白-肽结合、延长循环时间，还可凭借强电负性增强细胞通透性，即使在18F标记肽中，氟也可显著调节肽的理化行为，明确了氟修饰对优化放射性药物体内性能的价值，但目前尚无研究将氟代氨基酸修饰应用于PD-L1靶向D肽放射性配体的优化，也未明确氟修饰对放射性药物激活抗肿瘤免疫以及联合免疫治疗疗效的影响。
本研究的创新价值十分明确，首次将五氟代苯丙氨酸取代引入PD-L1靶向D肽序列，证实了氟修饰可同时提升D肽的结合亲和力、细胞通透性、肿瘤摄取与滞留能力，首次在临床前和初步临床层面验证了氟修饰D肽的诊断效能，同时明确了氟修饰提升放射性药物局部和系统性抗肿瘤免疫激活的机制，解决了现有D肽PD-L1靶向放射性配体靶标结合不足的核心问题，为放射诊疗药物联合免疫检查点阻断治疗提供了新的候选方案与优化范式。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体研究框架为：研究目标是开发靶标结合能力更强、肿瘤滞留时间更长的PD-L1靶向放射性药物，提升放射性药物治疗联合免疫检查点阻断的抗肿瘤疗效；核心科学问题是氟修饰是否能够优化D肽的理化性质与靶向能力，进而增强局部和系统性抗肿瘤免疫；技术路线遵循“关键位点筛选→氟修饰序列筛选→体外验证→体内临床前验证→初步临床验证→治疗疗效与机制验证”的完整闭环，逻辑清晰，验证层级完整。
3.1 D丙氨酸扫描筛选关键修饰位点
实验目的：通过D丙氨酸扫描确定DPA序列中适合开展氟修饰的关键残基，平衡靶标结合与药代动力学特征。方法细节：以PD-L1高表达的A375-PD-L1细胞和荷瘤BALB/c裸鼠为模型，将DPA序列中的每个D氨基酸逐一替换为D丙氨酸，得到一系列衍生物肽，通过表面等离子共振检测不同衍生物的PD-L1结合亲和力，随后对不同衍生物标记镓-68后开展荷瘤小鼠PET/CT成像，评估不同时间点的肿瘤摄取、正常器官积累以及药代动力学特征。结果解读：PET/CT成像结果显示原[68Ga]DPA存在肿瘤摄取不足、滞留时间短的缺陷，替换3位D酪氨酸为D丙氨酸得到的衍生物D3，相比原DPA结合亲和力显著提升，PET/CT显示其肿瘤摄取增加，心脏和肝脏非特异性积累降低，实现了靶标结合能力与药代动力学的最优平衡，其他位点替换要么导致结合亲和力显著下降，要么伴随正常器官非特异性积累升高，不符合后续研究要求，因此确定D3为后续氟修饰的基础序列。
实验所用关键产品：ABclonal的PD-L1一抗（货号A19135）、β-微管蛋白一抗（货号A12289）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶一抗（货号A19056）。
3.2 氟代D氨基酸取代筛选与体外验证
实验目的：在D3基础上通过不同氟修饰筛选得到性能最优的衍生物序列，验证其体外结合与细胞摄取能力。方法细节：将D3序列中的D苯丙氨酸替换为带有不同氟基团、不同氟原子数的衍生物，得到D3-1至D3-6共6个衍生物，通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测不同衍生物的细胞摄取能力，通过表面等离子共振测定平衡解离常数明确PD-L1结合亲和力，通过分子对接分析氟修饰后肽与PD-L1的相互作用变化。结果解读：带有五氟苯丙氨酸修饰的D3-6，细胞摄取显著高于D3以及其他氟修饰衍生物，对PD-L1的平衡解离常数KD为0.051nM（文献未明确提供样本量，P<0.05），分子对接结果显示D3-6的五氟苯丙氨酸可与PD-L1的SER117形成额外氢键，相比其他衍生物，D3-6与PD-L1形成的氢键数量最多、相互作用最强，因此确定D3-6为最优候选序列。
实验所用关键产品：Thermo的流式细胞术染色抗体，Keyence一体化荧光显微镜成像系统，Cytiva Biacore S200表面等离子共振仪。
3.3 荷瘤小鼠体内性能与安全性验证
实验目的：验证[68Ga]D3-6在荷瘤小鼠体内的肿瘤摄取、滞留、特异性以及安全性。方法细节：对PD-L1高表达的A375-PD-L1荷瘤小鼠、低PD-L1表达的MCF-7荷瘤小鼠分别注射[68Ga]D3-6、[68Ga]D3和[68Ga]DPA，在不同时间点开展PET/CT成像，定量计算肿瘤与各正常器官的放射性摄取百分比，随后开展离体生物分布研究验证结果，最后通过单次注射后15天的体重监测、血液生化分析以及主要器官组织病理染色评估安全性。结果解读：[68Ga]D3-6的放射性标记产率大于98%，在胎牛血清和磷酸盐缓冲液中稳定性良好，注射后30分钟肿瘤摄取为14.43±0.81%ID/g（n=3，P<0.05），60分钟升高至15.52±1.09%ID/g（n=3，P<0.01），240分钟达到峰值22.43±1.63%ID/g（n=3，P<0.001），肿瘤摄取随时间持续升高，显著高于[68Ga]DPA和[68Ga]D3，肾脏摄取没有显著升高，肿瘤/心脏、肿瘤/肝脏比值随时间逐渐升高并在后期超过[68Ga]D3，肿瘤/肾脏比值在所有时间点均为最高，低PD-L1表达的MCF-7模型肿瘤摄取显著降低，证明[68Ga]D3-6的肿瘤摄取具有PD-L1表达特异性，安全性评估显示注射后15天内，[68Ga]D3-6没有导致明显的主要器官毒性和血液毒性，安全性良好。
实验所用关键产品：Siemens Inveon microPET/CT扫描仪，PerkinElmer 2480 Wizard自动γ计数器。
3.4 初步临床PET/CT诊断效能验证
实验目的：在初步临床研究中验证[68Ga]D3-6对人体肿瘤的诊断效能与安全性。方法细节：共纳入5例不同类型的肿瘤患者，分别接受[68Ga]D3-6或[68Ga]DPA注射，注射后60分钟开展全身PET/CT成像，随访24小时监测不良反应与生命体征。结果解读：共纳入3例接受[68Ga]D3-6检查的患者，2例接受[68Ga]DPA检查的患者，[68Ga]D3-6对肿瘤转移灶的检测率为100%（9/9），而[68Ga]DPA仅为20%（1/5），[68Ga]D3-6可清晰显示不同类型肿瘤的原发灶与转移灶，最大标准摄取值与患者肿瘤PD-L1表达水平一致，可准确监测治疗后PD-L1表达变化，所有患者在检查后24小时内未发生不良事件，生命体征稳定，证明[68Ga]D3-6对人体肿瘤的诊断安全性好，诊断效能显著优于未修饰的[68Ga]DPA。
文献未提及特殊试验产品，采用临床常规PET/CT设备开展检查。
3.5 联合免疫治疗的抗肿瘤疗效验证
实验目的：验证[177Lu]D3-6联合抗PD-1免疫检查点阻断治疗的全身抗肿瘤疗效与安全性。方法细节：建立双侧荷瘤的4T1（三阴性乳腺癌）和CT26（结直肠癌）小鼠模型，将小鼠随机分为6组，分别为生理盐水组、[177Lu]D3组、[177Lu]D3-6组、抗PD-1单药组、[177Lu]D3联合抗PD-1组、[177Lu]D3-6联合抗PD-1组，每组n＞6，仅在右侧原发肿瘤内注射放射性药物，腹腔注射抗PD-1，每两天监测双侧肿瘤体积，每日监测小鼠生存，治疗结束后通过血液生化分析和主要器官组织病理染色评估安全性。结果解读：[177Lu]D3-6单药即可显著抑制原发肿瘤和远处肿瘤的生长，抗PD-1单药抑制效果不佳，[177Lu]D3-6联合抗PD-1组的原发和远处肿瘤抑制效果在所有组中最优，在4T1和CT26两种模型中，联合治疗组均实现了100%生存率，所有组小鼠体重没有显著变化，血液生化指标显示肝肾功能正常，主要器官组织病理染色未观察到明显病理损伤，证明联合治疗的安全性良好，抗肿瘤效果显著。
实验所用关键产品：Selleck的纳武利尤单抗（货号A2002），ABclonal的Ki67一抗（货号A20018）、干扰素-γ一抗（货号A23929）。
3.6 系统性抗肿瘤免疫激活机制分析
实验目的：明确[177Lu]D3-6联合抗PD-1激活全身抗肿瘤免疫的机制。方法细节：治疗后7天收集原发肿瘤、远处肿瘤、引流淋巴结和脾脏，制备单细胞悬液，通过流式细胞术分析T细胞、树突状细胞、巨噬细胞的比例和功能表型，明确免疫微环境的重塑特征。结果解读：[177Lu]D3-6治疗后，原发肿瘤中CD8+细胞毒性T细胞比例显著升高，效应分子干扰素-γ表达上调，耗竭标志物TOX和PD-1表达显著降低，记忆标志物CD62L表达升高，常规树突状细胞cDC1和cDC2比例升高，抗原呈递能力增强，M1型抗肿瘤巨噬细胞比例升高，M2型促肿瘤巨噬细胞比例降低，这种免疫表型的有益变化在远处肿瘤、引流淋巴结和脾脏中同样存在，联合抗PD-1后免疫激活效果进一步增强，说明[177Lu]D3-6通过诱导局部肿瘤细胞死亡释放肿瘤抗原，重编程肿瘤免疫微环境，促进抗原呈递，激活引流淋巴结和脾脏的肿瘤特异性T细胞，最终系统性激活的T细胞循环至远处肿瘤产生远隔杀伤效应。
实验所用关键产品：ABclonal的一抗产品，Thermo、BioLegend的流式染色抗体。
4. Biomarker研究及发现成果
Biomarker定位：本研究涉及的核心生物标志物为程序性死亡配体1（PD-L1），属于肿瘤免疫治疗的预测性蛋白生物标志物，用于指导免疫检查点阻断治疗的患者分层与疗效监测，本研究开发的放射性配体是PD-L1的成像探针，筛选验证逻辑为：基于PD-L1已明确的临床预测价值，在原有PD-L1靶向D肽基础上通过氟修饰优化得到新探针，依次通过体外结合实验、细胞摄取实验、荷瘤小鼠体内成像、临床患者PET/CT成像完成多层面验证。
研究过程详述：该生物标志物的来源为肿瘤组织的PD-L1蛋白，验证方法包括表面等离子共振结合实验、流式细胞术细胞摄取实验、PET/CT成像定量分析、流式细胞术免疫表型分析，特异性数据显示，在荷瘤小鼠模型中，高PD-L1表达肿瘤的[68Ga]D3-6摄取在注射后240分钟达到22.43±1.63%ID/g（n=3，P<0.001），低PD-L1表达肿瘤的摄取显著降低，证明探针摄取特异性与PD-L1表达水平正相关，在初步临床研究中，[68Ga]D3-6对PD-L1阳性肿瘤转移灶的检测率达到100%（9/9），显著优于未修饰的[68Ga]DPA（20%，1/5），检测准确性提升显著。
核心成果提炼：本研究开发的[68Ga]D3-6探针可精准定量体内肿瘤的PD-L1表达，还可监测治疗后PD-L1的表达变化，作为PD-L1成像的生物标志物探针，相比原有探针诊断准确性显著提升，为免疫检查点阻断治疗的患者分层和疗效监测提供了更精准的工具，同时，PD-L1靶向的[177Lu]D3-6通过特异性结合肿瘤PD-L1实现内照射治疗，联合抗PD-1后可显著提升系统性抗肿瘤免疫，在双侧荷瘤小鼠模型中，联合治疗对原发肿瘤的生长抑制率超过80%（n＞6，P<0.001），实现了100%的小鼠生存率，本研究首次验证了五氟修饰D肽PD-L1探针的诊断与治疗效果，明确了氟修饰提升D肽放射性药物肿瘤结合与免疫激活的机制，为PD-L1靶向放射诊疗联合免疫治疗提供了新的策略，具有重要的临床转化价值。