棕榈酸触发的 B7H3 棕榈酰化促进免疫逃逸。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Palmitic acid-triggered B7H3 palmitoylation promotes immune escape
发表期刊：Nature Communications；影响因子：17.694（2025年）；研究领域：结直肠癌免疫治疗、免疫检查点翻译后修饰

结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，免疫治疗为其带来了突破性进展，但目前仅错配修复缺陷/微卫星高度不稳定（MSI-H）亚型（约占15%）患者对PD-1/PD-L1抑制剂响应良好，而占多数的微卫星稳定（MSS）亚型患者因肿瘤免疫微环境高度抑制，现有免疫治疗手段疗效有限，亟需挖掘新的免疫调控靶点与机制。B7H3（CD276）作为新兴免疫检查点分子，在多种实体瘤中高表达，可抑制CD8+T细胞和自然杀伤细胞的抗肿瘤活性，与患者不良预后密切相关。现有研究表明B7H3的蛋白表达受翻译后修饰调控，N-糖基化是已知的稳定其膜定位的关键修饰，但其他翻译后修饰（如棕榈酰化）对B7H3功能的调控尚未阐明。棕榈酰化是一种重要的可逆翻译后修饰，可通过改变蛋白的脂溶性调控其稳定性、亚细胞定位及功能，已有研究证实PD-L1等免疫分子的棕榈酰化参与肿瘤免疫逃逸，但B7H3的棕榈酰化及其在MSS结直肠癌中的作用仍属空白。针对这一研究缺口，本研究聚焦MSS结直肠癌的免疫抑制机制，系统解析了棕榈酸（PA）触发的B7H3棕榈酰化介导免疫逃逸的分子机制，并开发了靶向该修饰的新型治疗策略，为MSS结直肠癌的免疫治疗提供了新方向。

2. 文献综述解析

作者对领域内现有研究的评述主要围绕三个维度展开：免疫检查点在结直肠癌中的亚型特异性作用、B7H3的翻译后修饰调控网络、棕榈酰化在免疫分子功能中的调控作用。

现有研究的关键结论包括：B7H3在多种恶性肿瘤中高表达，通过抑制CD8+T细胞的增殖与效应功能促进肿瘤免疫逃逸，其表达水平与患者不良预后显著相关；N-糖基化是调控B7H3蛋白稳定性与膜定位的核心翻译后修饰；棕榈酰化可通过调控PD-L1、NOD1/2等免疫分子的稳定性与定位，参与免疫应答的调控。技术方法方面，临床样本免疫组化与多组学分析可有效关联分子表达与临床特征，酰基-生物素交换（ABE）实验是检测蛋白棕榈酰化的经典方法，具有较高的特异性与灵敏度。但现有研究仍存在明显局限性：多数研究聚焦B7H3的表达水平与临床意义，对其翻译后修饰的调控机制尤其是棕榈酰化的研究严重不足；MSS结直肠癌的免疫抑制核心机制尚未完全阐明，缺乏有效的靶向治疗策略；催化B7H3棕榈酰化的关键酶及其下游调控通路仍不明确。

本研究的创新价值通过与现有研究的未解决问题对比凸显：首次发现PA触发的B7H3棕榈酰化是MSS结直肠癌免疫逃逸的关键驱动机制；鉴定出ZDHHC24是催化B7H3棕榈酰化的特异性酶；阐明了棕榈酰化通过抑制B7H3与自噬受体SQSTM1/p62的结合，阻断其自噬降解从而稳定蛋白的分子通路；设计并验证了靶向B7H3与ZDHHC24相互作用的E肽，可有效增强CD8+T细胞的抗肿瘤活性，且与抗PD-1治疗具有显著协同效应，填补了MSS结直肠癌免疫治疗靶点的空白，为该亚型患者的治疗提供了新的潜在方案。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究以MSS结直肠癌免疫抑制的核心科学问题为导向，研究目标是阐明B7H3棕榈酰化介导免疫逃逸的分子机制并开发靶向治疗策略，技术路线遵循“临床样本筛选→代谢组学与分子机制验证→细胞与动物功能验证→治疗策略开发与疗效验证”的完整闭环，逻辑严谨且层层递进。

3.1 临床样本与代谢组学筛选MSS结直肠癌中调控B7H3的关键代谢物

实验目的：明确MSS与MSI-H结直肠癌中B7家族分子的表达差异，筛选调控B7H3表达的关键代谢物。
方法细节：收集MSS和MSI-H结直肠癌患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本（队列1，n=10）进行免疫组化分析；对新鲜肿瘤样本进行RNA测序（队列4）和非靶向代谢组学分析（队列5，MSS n=8，MSI-H n=10）；用RKO结直肠癌细胞处理筛选到的5种脂肪酸代谢相关代谢物，通过免疫印迹检测B7H3蛋白表达。
结果解读：免疫组化结果显示MSS肿瘤中B7H3蛋白表达显著高于MSI-H肿瘤（Fig1A-B）；RNA测序与代谢组学分析表明MSS肿瘤中脂肪酸代谢通路显著富集，PA水平显著升高（Fig1C-F）；细胞处理实验证实仅PA可浓度依赖性增加B7H3蛋白水平（Fig1G-H）。

产品关联：实验所用关键产品：abcam的B7H3抗体（ab134161、ab227679）；ABclonal的GAPDH抗体（A19056）；Thermo Fisher的TRIzol试剂、LC-MS/MS平台等。

3.2 B7H3棕榈酰化对其蛋白稳定性的调控

实验目的：验证PA通过棕榈酰化修饰调控B7H3蛋白稳定性。
方法细节：采用ABE assay检测PA处理后B7H3的棕榈酰化水平；用广谱棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸（2-BP）和去棕榈酰化抑制剂palmostatin B处理细胞，检测B7H3的棕榈酰化水平与蛋白表达；用环己酰亚胺（CHX） chase实验检测B7H3的蛋白半衰期；进行细胞质与膜组分分离实验检测B7H3的亚细胞定位变化。
结果解读：PA处理可浓度依赖性增强B7H3的棕榈酰化水平（Fig1I）；2-BP处理显著降低B7H3的棕榈酰化水平与蛋白表达，而palmostatin B处理则呈现相反效应（Fig1J-K）；CHX chase实验显示2-BP可加速B7H3的降解，palmostatin B则延缓其降解（Fig1L-M）；细胞质与膜组分分离实验证实2-BP处理后，细胞质与膜组分中的B7H3表达均显著降低（FigS1S）。
产品关联：实验所用关键产品：MCE的2-BP（HY-111770）、palmostatin B（HY-120911）；Thermo Fisher的EZ-Link TM BMCC-biotin（21900）等。

3.3 B7H3棕榈酰化位点鉴定与自噬降解机制解析

实验目的：鉴定B7H3的关键棕榈酰化位点，阐明棕榈酰化调控B7H3稳定性的分子机制。
方法细节：通过GPS-palm、GPS-lipid和Swiss-Palm数据库预测B7H3的棕榈酰化位点，构建位点特异性突变体并通过ABE assay验证；用自噬通路抑制剂（3-MA、巴弗洛霉素A1、氯喹）和蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，明确B7H3的降解途径；用免疫共沉淀（Co-IP）实验验证B7H3与自噬受体的相互作用；构建B7H3 C496A突变体稳定细胞系，检测其蛋白稳定性与自噬降解情况。
结果解读：实验证实C496是B7H3的关键棕榈酰化位点，该位点突变后B7H3的棕榈酰化水平几乎完全消失（Fig2I-J）；自噬通路抑制剂可有效阻断2-BP诱导的B7H3降解，而MG132无此效应，说明B7H3主要通过自噬-溶酶体途径降解（Fig2A-B）；Co-IP实验显示B7H3与自噬受体SQSTM1/p62直接结合，C496A突变体与SQSTM1/p62的结合亲和力显著增强（Fig2E、L）；CHX chase实验显示C496A突变体的蛋白半衰期显著缩短（Fig2N-O）；共聚焦显微镜观察到C496A突变体与LC3、SQSTM1/p62的共定位显著增加，证实棕榈酰化可抑制B7H3的自噬降解（Fig2P）。

产品关联：实验所用关键产品：MCE的3-MA（HY-19312）、巴弗洛霉素A1（HY-100558）、氯喹（HY-17589A）；HUABIO的SQSTM1/p62抗体（HA721171）等。

3.4 ZDHHC24作为B7H3棕榈酰化催化酶的验证

实验目的：鉴定催化B7H3棕榈酰化的ZDHHC家族酶，并验证其功能与临床意义。
方法细节：共表达23种ZDHHC家族酶与B7H3，通过ABE assay筛选可增强B7H3棕榈酰化的酶；用Co-IP与免疫荧光实验验证ZDHHC24与B7H3的相互作用；构建ZDHHC24敲低与过表达细胞系，检测B7H3的棕榈酰化水平与蛋白稳定性；通过临床样本免疫组化分析ZDHHC24表达与B7H3水平、患者预后的关联。
结果解读：ZDHHC24可显著增强B7H3的棕榈酰化水平与蛋白表达，是催化B7H3棕榈酰化的关键酶（FigS4A-E）；Co-IP与免疫荧光实验证实ZDHHC24与B7H3存在内源性相互作用并在细胞内共定位（Fig4A-B）；ZDHHC24敲低可显著降低B7H3的棕榈酰化水平与蛋白表达，加速其自噬降解（Fig4C-H）；临床样本分析显示ZDHHC24高表达与B7H3水平正相关，且与结直肠癌患者不良预后显著相关（Fig4N-Q）。

产品关联：实验所用关键产品：aviva systems biology的ZDHHC24抗体（ARP55989_P050）；Atlas antibodies的ZDHHC24抗体（HPA016619）；MiaoLingBio的ZDHHC家族质粒等。

3.5 B7H3棕榈酰化对肿瘤免疫微环境的调控

实验目的：验证B7H3棕榈酰化通过抑制CD8+T细胞活性介导肿瘤免疫逃逸。
方法细节：构建B7H3棕榈酰化缺陷的小鼠结肠癌细胞系（CT26C278A、MC38C278A），分别移植到免疫健全（BALB/c、C57BL/6J）与免疫缺陷（NCG）小鼠体内，检测肿瘤生长情况；用流式细胞术与免疫荧光实验分析肿瘤浸润免疫细胞的组成与功能；通过CD8+T细胞耗竭实验验证其在棕榈酰化介导免疫逃逸中的核心作用；用T细胞杀伤实验检测棕榈酰化缺陷对肿瘤细胞敏感性的影响。
结果解读：免疫健全小鼠中，棕榈酰化缺陷组的肿瘤生长显著受抑，而免疫缺陷小鼠中两组肿瘤生长无显著差异，证实棕榈酰化的免疫抑制作用依赖宿主免疫系统（Fig3A-D）；流式细胞术分析显示棕榈酰化缺陷组肿瘤中CD8+T、CD4+T、NK细胞的浸润显著增加，而单核细胞源性髓系抑制细胞（M-MDSCs）、多形核髓系抑制细胞（PMN-MDSCs）的浸润显著减少（Fig3E-H）；CD8+T细胞耗竭后，棕榈酰化缺陷组的肿瘤生长抑制效应完全消失，证实CD8+T细胞是棕榈酰化介导免疫逃逸的核心效应细胞（Fig3I-K）；T细胞杀伤实验显示棕榈酰化缺陷的肿瘤细胞对CD8+T细胞的杀伤敏感性显著增强（Fig3S-T）。

产品关联：实验所用关键产品：BioLegend的Zombie NIR Fixable Viability Kit（423106）；BD的流式抗体（如FITC mouse anti-human CD45 560976）；MCE的LDH细胞毒性检测试剂盒（HY-K1090）等。

3.6 E肽的设计与体内外功能验证

实验目的：设计靶向ZDHHC24与B7H3相互作用的肽段，验证其对B7H3棕榈酰化与抗肿瘤免疫的调控效应。
方法细节：通过结构域缺失实验确定B7H3与ZDHHC24相互作用的关键区域（aa488-497），设计对应该区域的E肽与随机序列对照C肽；用Co-IP实验验证E肽对ZDHHC24与B7H3相互作用的抑制效应；用ABE assay检测E肽对B7H3棕榈酰化水平的影响；通过T细胞杀伤实验与小鼠移植瘤模型验证E肽的体内外疗效。
结果解读：结构域缺失实验证实B7H3的aa488-497区域是与ZDHHC24相互作用的核心区域（Fig7A-B）；E肽可竞争性抑制ZDHHC24与B7H3的结合，显著降低B7H3的棕榈酰化水平并促进其自噬降解（Fig7D-J）；T细胞杀伤实验显示E肽处理可显著增强CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性（Fig7K-L）；小鼠移植瘤模型证实E肽可显著抑制肿瘤生长，增加肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润及效应分子GZMB、IFN-γ的表达（Fig8B-V）。

产品关联：实验所用关键产品：ChinaPeptides Co., Ltd.合成的E肽与C肽；GE Healthcare的Biacore 8K仪器用于表面等离子体共振（SPR）分析；MCE的细胞毒性检测试剂盒等。

3.7 E肽联合抗PD-1的协同疗效验证

实验目的：验证E肽与抗PD-1联合治疗的协同抗肿瘤效应。
方法细节：构建CT26-luciferase与MC38小鼠移植瘤模型，分别给予E肽单药、抗PD-1单药、联合治疗，通过活体成像与肿瘤体积测量评估肿瘤生长情况；用流式细胞术分析肿瘤浸润CD8+T细胞的数量与功能；采用Bliss模型分析联合治疗的协同效应。
结果解读：联合治疗组的肿瘤生长抑制效应显著优于单药组，小鼠的生存时间显著延长，其中1例小鼠实现肿瘤完全消退（Fig9A-G）；流式细胞术分析显示联合治疗组的CD8+T细胞浸润显著增加，效应分子GZMB与IFN-γ的表达水平显著升高（Fig9J-L）；Bliss模型分析证实E肽与抗PD-1治疗具有显著的协同抗肿瘤效应。

产品关联：实验所用关键产品：领域常规使用BioXCell的抗PD-1抗体；PerkinElmer的活体成像系统用于检测luciferase信号等。

4. Biomarker研究及发现成果解析

本研究涉及三类核心Biomarker：B7H3棕榈酰化修饰、ZDHHC24表达水平，以及E肽作为治疗性靶点。其中B7H3棕榈酰化与ZDHHC24为诊断与预后Biomarker，E肽为治疗性Biomarker。

Biomarker定位与筛选逻辑

B7H3棕榈酰化的筛选逻辑为：通过临床样本对比MSS与MSI-H结直肠癌的B7H3表达差异，结合代谢组学分析筛选到PA是调控B7H3的关键代谢物，进而通过ABE assay验证PA触发B7H3棕榈酰化；ZDHHC24的筛选逻辑为：通过ZDHHC家族酶的过表达筛选，结合Co-IP与免疫荧光实验验证其与B7H3的相互作用，再通过临床样本关联分析明确其临床意义；E肽的设计逻辑为：通过结构域缺失实验确定B7H3与ZDHHC24相互作用的关键区域，基于该区域设计竞争性结合肽段，通过功能实验验证其靶向效应。

研究过程详述

B7H3棕榈酰化的来源为MSS结直肠癌患者肿瘤组织中升高的PA，验证方法包括ABE assay、免疫组化、细胞功能实验，其特异性表现为仅在MSS结直肠癌中显著升高，敏感性表现为PA可浓度依赖性调控其水平；ZDHHC24的来源为结直肠肿瘤细胞，验证方法包括Co-IP、免疫荧光、临床样本免疫组化，其表达与B7H3棕榈酰化水平正相关，与结直肠癌患者不良预后显著相关（Kaplan-Meier分析显示高表达组中位生存时间显著短于低表达组，Fig4N）；E肽的验证方法包括SPR分析、细胞杀伤实验、小鼠移植瘤模型，其可特异性抑制ZDHHC24与B7H3的结合，降低B7H3棕榈酰化水平，增强CD8+T细胞的抗肿瘤活性，联合抗PD-1治疗的协同效应显著（肿瘤体积缩小至单药组的约30%，Fig9B）。

核心成果提炼

B7H3 C496棕榈酰化是MSS结直肠癌免疫逃逸的关键功能Biomarker，通过抑制B7H3与SQSTM1/p62的结合阻断自噬降解，稳定B7H3蛋白从而抑制CD8+T细胞的抗肿瘤活性；ZDHHC24是结直肠癌预后不良的Biomarker，其表达水平与B7H3棕榈酰化正相关，可作为MSS结直肠癌患者的预后评估指标；E肽作为靶向B7H3棕榈酰化的治疗性Biomarker，可有效逆转MSS结直肠癌的免疫抑制状态，与抗PD-1治疗具有协同效应，为MSS结直肠癌的免疫治疗提供了新的潜在方案。