肿瘤内唾液乳杆菌的细菌囊泡通过 FPR1 介导的巨噬细胞极化增强胃癌中的 PD-1 阻断作用。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Bacterial vesicles from intratumoralL. salivariusenhance PD-1 blockade via FPR1-mediated macrophage polarization in gastric cancer；
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：胃癌肿瘤微环境与免疫治疗，肠道菌群与肿瘤免疫。

胃癌具有高度肿瘤内异质性和侵袭性生物学行为，多数患者确诊时已处于晚期，复发率高，尽管近年来治疗策略取得明显进展，多数患者临床预后仍不理想，核心问题在于肿瘤微环境（TME）内复杂的宿主-微生物相互作用尚未阐明。近年临床研究证实，免疫检查点阻断（ICB）治疗可使部分胃癌患者获益，尤其是TME高免疫原性、富集CD8+T细胞、辅助性T细胞1型、促炎巨噬细胞和自然杀伤细胞的患者获益更显著，但整体ICB治疗响应率仍有待提升。

领域共识：传统观点认为胃内酸性环境不利于微生物定植，高通量测序技术的发展揭示了胃内存在独特且多样的胃部菌群，部分菌种如咽峡炎链球菌、具核梭杆菌已被证实通过与上皮细胞直接互作促进胃癌发生，但是胃部微生物的免疫调节作用仍不明确。现有研究提示肿瘤内细菌是抗肿瘤免疫的活性调节因子，既可以通过促进抗原呈递和免疫激活增强免疫监视，也可以诱导T细胞功能异常，塑造免疫抑制性TME。因此，解析胃部宿主-菌群互作有望揭示免疫逃逸机制，为胃癌免疫治疗提供新策略。

近年研究证实，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均可释放细菌胞外囊泡（bEVs），bEVs富集微生物相关分子模式，可作为天然信号传递载体激活先天和适应性免疫，能够通过干扰素γ、CXCL10介导的通路诱导强烈持久的抗肿瘤免疫应答，且无明显全身毒性。但肿瘤内细菌来源的bEVs在胃癌中调控抗肿瘤免疫的作用仍未被探索。本研究针对这一研究空白，探索胃癌肿瘤内唾液乳杆菌及其囊泡调控抗肿瘤免疫、增强PD-1阻断疗效的分子机制，为胃癌免疫治疗提供新的靶点与方向。

2. 文献综述解析

现有胃癌相关菌群研究多聚焦于促肿瘤菌种的鉴定与机制解析，已明确咽峡炎链球菌通过TMPC-ANXA2-MAPK轴、具核梭杆菌通过白介素-17/NF-κB/RelB通路促进胃癌进展，但关于肿瘤内微生物如何调控TME进而影响免疫治疗响应这一核心问题，现有研究尚未给出明确解答。关于细菌囊泡的免疫调控作用，现有研究普遍认为bEVs可作为免疫调节介质，通过Toll样受体、NOD样受体等模式识别受体激活宿主先天免疫，触发炎症反应和肿瘤细胞凋亡，多数研究认为bEVs可直接激活CD8+T细胞发挥抗肿瘤作用。

本研究相较于现有研究的创新价值体现在三个方面：首先，首次在胃癌中明确肿瘤内唾液乳杆菌丰度降低与免疫治疗低响应相关，证实外源性补充唾液乳杆菌可显著增强ICB疗效，拓展了益生菌在肿瘤免疫治疗中的应用场景；其次，明确了唾液乳杆菌来源bEVs并非直接激活CD8+T细胞，而是通过递送特定细菌蛋白靶向巨噬细胞甲酰肽受体1（FPR1），间接重塑TME增强ICB疗效，揭示了全新的菌群-免疫互作机制；最后，首次发现细菌来源的2,3-二磷酸甘油酸依赖的磷酸甘油酸变位酶（2,3-BdpM）可作为FPR1的配体，拓展了FPR1的配体库，填补了肿瘤内菌群调控胃癌免疫治疗响应的研究空白，为益生菌联合免疫治疗、细菌囊泡作为免疫治疗佐剂提供了新的理论依据。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究整体研究框架：研究目标是明确肿瘤内特定微生物与胃癌免疫治疗响应的关联，阐明其调控抗肿瘤免疫、增强PD-1阻断疗效的分子机制；核心科学问题是肿瘤内唾液乳杆菌是否影响胃癌免疫治疗疗效，其发挥免疫调控作用的活性分子与具体机制是什么；技术路线遵循「临床样本筛选差异菌种→体内外验证菌种对免疫治疗的增敏作用→分离鉴定活性组分→明确作用靶点与信号通路→体内验证功能并探索临床转化潜能」的完整闭环逻辑。

3.1 临床样本与小鼠模型筛选差异菌种

实验目的：筛选胃癌组织中丰度存在差异，且与免疫治疗响应相关的肿瘤内微生物。方法细节：采用幽门螺杆菌SS1联合N-甲基-N-亚硝基脲诱导的自发性胃癌小鼠模型，开发优化的原位取样技术：结扎胃远近端后缓慢盐水灌流冲洗胃腔，收集胃液以排除其他区域微生物污染，对年龄性别匹配的荷瘤和正常小鼠胃液进行16S rRNA测序；收集68例胃癌患者配对肿瘤和癌旁正常组织（距肿瘤边缘>8cm），其中未接受免疫治疗46例，接受免疫治疗22例（根据iRECIST标准分类，响应者17例，无响应者5例），采用定量逆转录聚合酶链反应和荧光原位杂交验证目标菌种丰度。结果解读：胃癌小鼠的Ligilactobacillus属丰度显著降低，其中唾液乳杆菌在人胃癌组织中丰度也显著低于配对癌旁组织（n=36，P<0.05）；接受免疫治疗的患者肿瘤组织中唾液乳杆菌丰度显著高于未接受免疫治疗患者，且免疫治疗响应者肿瘤内唾液乳杆菌丰度显著高于无响应者（n=22，P<0.01）。结论：胃癌肿瘤组织中唾液乳杆菌丰度降低，其丰度与免疫治疗响应正相关。文献未提及具体实验产品，领域常规使用测序试剂盒、荧光原位杂交探针、PCR试剂。

3.2 唾液乳杆菌增敏抗PD-1免疫治疗的体内验证

实验目的：明确唾液乳杆菌联合抗PD-1在胃癌小鼠模型中的抗肿瘤疗效。方法细节：构建四种胃癌小鼠模型：ATPM自发胃癌模型、MFC细胞皮下移植瘤模型、ATPM原代肿瘤细胞皮下模型、幽门螺杆菌SS1+N-甲基-N-亚硝基脲诱导的原代胃癌细胞皮下模型；小鼠经抗生素预处理清除原有菌群后分为四组：对照组、唾液乳杆菌组、抗PD-1组、唾液乳杆菌联合抗PD-1组；监测肿瘤体积、重量、小鼠生存期，治疗结束后采用流式细胞术检测肿瘤浸润免疫细胞比例。结果解读：在所有胃癌模型中，唾液乳杆菌单药可轻度抑制肿瘤生长，联合抗PD-1可显著增强抗肿瘤疗效，MFC皮下模型中联合治疗组肿瘤体积和重量显著低于抗PD-1单药组（n=8，P<0.01），ATPM自发模型中小鼠生存期显著延长（n=10，P<0.001）；流式结果显示，唾液乳杆菌单药或联合抗PD-1均可显著增加肿瘤内CD8+T细胞浸润比例、CD86+促炎巨噬细胞比例，同时上调CD8+T细胞中干扰素γ和颗粒酶B的表达（n=5，P<0.05）。结论：唾液乳杆菌通过重塑肿瘤免疫微环境，增强抗PD-1免疫治疗的抗肿瘤效果。文献未提及具体实验产品，领域常规使用小鼠饲养耗材、流式抗体、抗体治疗试剂。

3.3 唾液乳杆菌活性组分的分离鉴定

实验目的：筛选唾液乳杆菌发挥免疫调控作用的核心活性组分。方法细节：分离唾液乳杆菌培养上清，去除菌体后超速离心分离细菌囊泡（bEVs），获得含bEVs上清和去除bEVs的上清；对培养上清进行非靶向代谢组学分析，筛选差异富集代谢物，分别检测不同组分对外周血单核细胞免疫调节能力的影响，采用透射电镜和纳米颗粒跟踪分析对bEVs进行表征。结果解读：代谢组学分析发现唾液乳杆菌上清富集柠檬酸、2-羟基己酸、苯乳酸，体外实验显示这些代谢物对免疫细胞的调控作用有限；去除bEVs后的上清促免疫激活能力显著低于含bEVs的上清，含bEVs上清可显著增加CD8+T细胞比例，促进干扰素γ和颗粒酶B产生，同时增加促炎巨噬细胞比例（n=3，P<0.05）；透射电镜观察到bEVs为典型囊泡结构，纳米颗粒跟踪分析显示其粒径符合细菌囊泡的正常范围。结论：bEVs是唾液乳杆菌发挥免疫调控作用的核心活性组分。文献未提及具体实验产品，领域常规使用超速离心设备、代谢组学检测试剂、电镜试剂。

3.4 bEVs对胃癌细胞的直接作用及靶点鉴定

实验目的：探究高浓度bEVs对胃癌细胞增殖的直接影响并鉴定其作用靶点。方法细节：分离得到bEVs后，处理不同浓度的胃癌细胞系（AGS、HGC-27）和正常胃上皮细胞GES-1，CCK-8法检测细胞增殖；构建小鼠和人胃癌来源的类器官，检测不同浓度bEVs处理后类器官生长情况；对bEV处理后的AGS和GES-1细胞进行转录组测序，筛选差异表达受体，蛋白质印迹法验证差异表达，短发夹RNA敲低候选受体后检测细胞凋亡变化。结果解读：20μg/mL唾液乳杆菌培养上清、2μg/mL bEVs可显著抑制胃癌细胞增殖，对正常胃上皮细胞增殖无显著影响（n=3，P<0.05）；1μg/mL或2μg/mL bEVs处理可显著抑制胃癌类器官生长，诱导类器官凋亡塌陷（n=3，P<0.01）；转录组测序发现，柯萨奇病毒和腺病毒受体（CXADR）在胃癌细胞中高表达，且bEV处理后表达显著下调，蛋白质印迹验证了这一结果，CXADR过表达可显著逆转bEV诱导的胃癌细胞凋亡（n=3，P<0.01）。结论：高浓度bEVs可通过下调CXADR直接抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡。文献未提及具体实验产品，领域常规使用细胞培养试剂、转录组测序试剂盒、蛋白印迹试剂。

3.5 bEVs免疫调控作用的靶点与机制探究

实验目的：明确低浓度bEVs调控巨噬细胞极化的分子靶点和信号通路。方法细节：构建胃癌类器官与小鼠脾细胞共培养体系，低浓度bEVs处理后检测免疫细胞比例和杀伤功能；通过体内荧光成像检测DiR标记bEVs在体内的分布；分离骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和CD8+T细胞，构建BMDM与CD8+T细胞共培养体系，检测bEV处理后巨噬细胞极化和CD8+T细胞功能；对bEV处理后的BMDMs进行转录组测序，筛选差异表达基因，短发夹RNA敲低候选基因后检测功能，免疫荧光检测bEV与靶点蛋白的共定位；蛋白质印迹检测下游信号通路激活情况。结果解读：低浓度bEVs（0.1μg/mL）不影响胃癌类器官生长，但可显著增强脾细胞对胃癌类器官的杀伤作用，流式检测显示bEV处理后共培养体系中CD8+T细胞比例增加、干扰素γ表达上调，同时促炎巨噬细胞比例显著增加（n=3，P<0.05）；体内成像显示，注射的DiR标记bEVs可选择性富集在胃癌组织中，在正常组织中分布极少；共培养实验证实，bEV处理后的BMDMs可显著增强CD8+T细胞的干扰素γ和颗粒酶B表达，提升CD8+T细胞对胃癌细胞的杀伤能力（n=3，P<0.01）；转录组测序显示，bEV处理后BMDMs中Fpr1（甲酰肽受体1）mRNA和蛋白表达显著上调，敲低Fpr1可显著抑制bEV诱导的促炎巨噬细胞极化，免疫荧光证实bEV与FPR1在巨噬细胞膜上共定位；敲低Fpr1可显著抑制bEV诱导的MAPK和NF-κB通路蛋白磷酸化，JAK-STAT通路无明显变化。结论：bEVs通过激活巨噬细胞FPR1-MAPK/NF-κB通路，促进巨噬细胞向促炎抗肿瘤表型极化，进而增强CD8+T细胞的抗肿瘤细胞毒性。文献未提及具体实验产品，领域常规使用流式细胞仪、共聚焦显微镜、转录组测序试剂。

3.6 bEVs中结合FPR1的活性蛋白鉴定

实验目的：鉴定bEVs中与FPR1结合的核心活性蛋白。方法细节：采用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的FPR1蛋白沉淀bEVs总蛋白，液相色谱-质谱联合鉴定候选结合蛋白；AlphaFold3分子对接筛选高亲和力结合蛋白，重组表达候选蛋白后，GST pull-down和免疫共沉淀验证蛋白相互作用；检测重组蛋白对巨噬细胞FPR1表达和极化的影响，蛋白质印迹验证下游信号通路。结果解读：GST pull-down联合质谱筛选得到21个候选结合蛋白，分子对接筛选得到2个高亲和力候选蛋白：2,3-二磷酸甘油酸依赖的磷酸甘油酸变位酶（2,3-BdpM）和含LysM结构域的肽聚糖结合蛋白；pull-down和免疫共沉淀证实2,3-BdpM与FPR1的结合亲和力更强；0.1μg/mL 2,3-BdpM即可显著上调巨噬细胞FPR1表达，促进巨噬细胞向促炎表型极化，该效应可被Fpr1敲低完全阻断（n=3，P<0.01）；蛋白质印迹证实，2,3-BdpM可激活MAPK和NF-κB通路，该效应同样依赖FPR1。结论：唾液乳杆菌bEVs中的2,3-BdpM是结合激活FPR1的核心活性蛋白。文献未提及具体实验产品，领域常规使用质谱仪、分子对接分析工具、蛋白表达纯化试剂。

3.7 2,3-BdpM联合抗PD-1的体内疗效验证

实验目的：体内验证2,3-BdpM联合抗PD-1的抗肿瘤疗效。方法细节：在皮下移植瘤和自发胃癌小鼠模型中，分为四组：对照组、2,3-BdpM组、抗PD-1组、2,3-BdpM联合抗PD-1组，监测肿瘤体积、重量和小鼠生存期，流式检测肿瘤浸润免疫细胞比例。结果解读：2,3-BdpM单药可轻度抑制肿瘤生长，联合抗PD-1可显著缩小肿瘤体积、降低肿瘤重量，延长小鼠生存期（皮下模型肿瘤体积n=8，P<0.01；生存期n=10，P<0.001）；流式检测显示，2,3-BdpM单药或联合抗PD-1可显著增加肿瘤内CD8+T细胞浸润比例、CD86+促炎巨噬细胞比例，同时上调CD8+T细胞中干扰素γ和颗粒酶B的表达（n=5，P<0.05）。结论：2,3-BdpM可显著增强抗PD-1免疫治疗的抗肿瘤疗效。文献未提及具体实验产品，领域常规使用动物成像设备、流式抗体。

3.8 2,3-BdpM联合CAR-Claudin18.2巨噬细胞的疗效验证

实验目的：探索2,3-BdpM在嵌合抗原受体（CAR）巨噬细胞治疗中的应用潜能。方法细节：构建表达Claudin18.2的CAR巨噬细胞（CAR-Claudin18.2+M），用2,3-BdpM或Fpr1敲低慢病毒处理CAR-M，然后与原代胃癌细胞、胃癌类器官共培养，检测CAR-M对胃癌细胞的杀伤能力；在NOD-SCID小鼠皮下种植原代胃癌细胞，然后注射预处理后的CAR-M，监测肿瘤生长并评估安全性。结果解读：2,3-BdpM处理可显著促进CAR-M向促炎表型极化，增强CAR-M对胃癌细胞和胃癌类器官的杀伤能力，该效应被Fpr1敲低显著削弱（n=3，P<0.01）；体内实验显示，2,3-BdpM预处理的CAR-M可显著抑制皮下胃癌生长，对主要脏器未观察到明显毒性（n=5，P<0.01）。结论：2,3-BdpM可通过激活FPR1增强CAR-Claudin18.2巨噬细胞的抗肿瘤活性，具有良好的临床转化潜能。文献未提及具体实验产品，领域常规使用慢病毒包装试剂、细胞培养耗材。

4. Biomarker研究及发现成果

Biomarker定位与筛选逻辑

本研究鉴定出的潜在生物标志物是肿瘤内唾液乳杆菌丰度，可用于预测胃癌患者PD-1免疫治疗的响应情况，筛选逻辑遵循：小鼠16S rRNA测序筛选胃癌和正常胃组织差异菌种→临床样本验证不同免疫治疗响应人群的丰度差异→多种小鼠模型验证丰度与治疗疗效的关联，逻辑链条完整。

研究过程详述

该标志物的来源是临床胃癌患者的肿瘤组织样本，验证方法为定量逆转录聚合酶链反应和荧光原位杂交，纳入临床样本总例数为68例，其中未接受免疫治疗46例，接受免疫治疗22例，免疫治疗响应者17例，非响应者5例。验证结果显示：胃癌组织中唾液乳杆菌丰度显著低于配对癌旁正常组织（n=36，P<0.05）；接受免疫治疗的患者肿瘤组织中唾液乳杆菌丰度显著高于未接受免疫治疗的患者（n=68，P<0.01），且免疫治疗响应者肿瘤内唾液乳杆菌丰度显著高于非响应者（n=22，P<0.01）。

核心成果提炼

本研究首次证实，胃癌肿瘤组织中唾液乳杆菌丰度与PD-1免疫治疗响应呈正相关，可作为预测免疫治疗响应的潜在微生物标志物。同时，本研究揭示了全新的肿瘤内微生物-免疫调控轴：唾液乳杆菌通过释放bEVs将细菌特有的2,3-BdpM递送至巨噬细胞，激活FPR1介导的MAPK和NF-κB信号通路，促进巨噬细胞向促炎抗肿瘤表型极化，进而增强CD8+T细胞的抗肿瘤细胞毒性，最终增强PD-1阻断治疗的疗效。该研究不仅为胃癌免疫治疗提供了新的预测标志物，还揭示了全新的治疗靶点，为益生菌联合免疫治疗、细菌囊泡作为免疫佐剂，以及2,3-BdpM联合CAR巨噬细胞治疗提供了新的方向，具有重要的基础研究价值和临床转化潜能。