卡介苗接种可诱导Vβ1/3 T细胞产生抗菌效应功能，从而起到预防结核病的作用。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：BCG vaccination induces antibacterial effector functions among Vδ1/3 T cells that are associated with protection against tuberculosis；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：结核病免疫学，γδT细胞功能研究。

卡介苗（BCG）是目前唯一获批用于结核病预防的疫苗，研发至今已有超过一个世纪的历史。领域共识：BCG对儿童重症结核病的保护效率约为80%，但对成人肺结核仅存在部分保护效果，而成人肺结核是结核病传播的主要来源；近年研究发现静脉注射BCG可以在恒河猴模型中诱导显著的抗结核保护效果，为解析BCG诱导保护的细胞机制提供了研究模型。已有研究证实T细胞免疫是介导BCG保护效应的核心，剂量梯度研究发现CD4、CD8 T细胞中细胞因子产生亚群的频率与保护相关，抗体耗竭实验也证实CD4、CD8 T细胞缺失会导致BCG保护效应消失。γδT细胞是同时具有固有免疫和适应性免疫特征的T细胞亚群，根据TCR基因使用分为Vγ9Vδ2和Vδ1/3两个主要亚群，已有大量研究证实Vγ9Vδ2 T细胞在BCG接种或结核感染后产生记忆应答，激活扩增Vγ9Vδ2 T细胞可以减轻恒河猴结核病变，证实γδT细胞在抗结核免疫中发挥重要作用。

但目前领域中关于Vδ1/3 T细胞在结核分枝杆菌控制中的作用研究极少，仅明确Vδ1/3 T细胞可以识别细菌感染和细胞应激过程中上调的内源性蛋白，其具体功能、是否参与BCG诱导的抗结核保护性免疫尚未明确，是该领域的核心研究空白。本研究分别在BCG接种的人婴儿和静脉BCG接种的恒河猴两个模型中，解析Vδ1/3 T细胞的表型、功能、TCR库特征，明确其与抗结核保护的相关性，填补了领域空白，为后续结核疫苗研发提供了新的方向和免疫相关性标志物。

2. 文献综述解析

作者对现有研究按照γδT细胞亚群分类维度进行梳理，首先总结了γδT细胞的基本分类和功能特征，明确γδT细胞表达TCRγ和TCRδ链，在屏障组织富集，同时具有TCR依赖和非依赖激活方式，分为Vγ9Vδ2和Vδ1/3两个主要亚群。对于Vγ9Vδ2亚群，现有研究已经明确其通过嗜乳脂蛋白分子识别磷酸抗原，在人或恒河猴皮内BCG接种或结核感染后会产生原发和记忆应答，部分Vγ9Vδ2 T细胞可以识别结核分枝杆菌来源的甲基葡萄糖多糖，抑制胞内BCG存活，靶向激活扩增Vγ9Vδ2 T细胞的疫苗以及过继转移Vγ9Vδ2 T细胞都可以减轻恒河猴肺结核病变，这些研究为γδT细胞在抗结核保护中的因果作用提供了明确证据。在人体研究中也证实，人婴儿皮内BCG接种后血液中表达干扰素-γ的γδT细胞扩增，结核感染的青少年血液中NK样CD8阳性γδT细胞扩增，进一步支持γδT细胞参与抗结核免疫。

对于Vδ1/3亚群，现有研究仅明确其可靶向细菌感染和细胞应激中上调的内源性蛋白，包括CD1b、CD1c、MICA、MR1等，但关于Vδ1/3 T细胞在BCG接种后的功能以及在结核控制中的作用几乎没有研究，属于未解决的核心问题。相较于现有研究，本研究的创新点十分明确，首次在两种不同的BCG保护模型中同时证实，BCG接种可以诱导Vδ1/3 T细胞发生克隆扩增，上调细胞毒性和促炎效应功能，并且首次发现气道中Vδ1/3 T细胞的频率和功能与结核攻毒后的保护效果显著相关，扩展了BCG诱导的保护性免疫相关细胞和分子的范围，为结核病疫苗研发提供了新的靶点，具有明确的学术必要性和应用价值。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标为明确BCG接种后Vδ1/3 T细胞的表型、功能和克隆扩增特征，验证Vδ1/3 T细胞是否与BCG诱导的抗结核保护相关；核心科学问题是Vδ1/3 T细胞是否参与BCG诱导的抗结核保护性免疫；技术路线遵循“人样本发现→动物模型验证→相关性分析确认”的逻辑，首先在BCG接种的人婴儿中通过单细胞测序分析Vδ1/3 T细胞的转录组和克隆特征，流式验证功能，再在恒河猴静脉BCG模型中重复验证功能特征，分析克隆扩增的TCR依赖性，最后结合大样本攻毒数据明确其与保护的相关性，形成完整的研究闭环。

3.1 人婴儿BCG接种后γδT细胞单细胞分析

实验目的：分析出生接种BCG的10周龄婴儿外周Vδ1/3 T细胞的转录组特征和克隆扩增情况。方法细节：纳入6名出生后接种皮内BCG的南非10周龄婴儿，采集外周血分离单个核细胞，染色后分选活的γδT细胞，进行单细胞RNA测序和TCR测序，经过质量控制过滤后对细胞进行聚类，分析不同亚群的基因表达特征和克隆扩增分布。结果解读：共获得14302个高质量γδT细胞，平均每个婴儿2033个细胞，聚类得到9个细胞亚群，其中43%的细胞为Vγ9Vδ2 T细胞，配对TCR分析显示Vγ9阴性γδT细胞中73%为Vδ1阳性，13%为Vδ3阳性，符合Vδ1/3 T细胞的分类定义。扩增的Vδ1/3克隆型（克隆计数≥2）显著富集在第3细胞亚群，该亚群低表达幼稚表型相关基因，高表达细胞毒性基因、T细胞激活相关基因以及促炎功能关键转录因子TXB21，说明克隆扩增的Vδ1/3 T细胞在BCG接种婴儿中呈现激活的细胞毒性效应表型。

实验所用关键产品：GE Healthcare的Ficoll-Paque PLUS、Invitrogen的LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit、eBioscience的Fc Block、BD Biosciences的FACSAria细胞分选仪、10x Genomics的Chromium Next GEM Single Cell V(D)J Reagent kit (v1.1)、Illumina的NovaSeq 6000测序系统。

3.2 人婴儿Vδ1/3 T细胞功能流式验证

实验目的：验证单细胞测序发现的BCG接种婴儿Vδ1/3 T细胞的细胞毒性功能特征。方法细节：纳入22名BCG接种的10周龄婴儿，以21名脐带血作为对照，分离外周血单个核细胞，分为结核全细胞裂解物刺激组和未刺激组，用流式细胞术分析Vγ9阴性Vδ1/3 T细胞中激活标志物CD137、细胞毒性标志物CD107a、颗粒酶B、颗粒酶K，以及细胞因子干扰素-γ、肿瘤坏死因子的表达频率，统计组间差异。结果解读：未刺激条件下，BCG接种婴儿中平均7%的Vδ1/3 T细胞表达颗粒酶B，频率是脐带血组的2倍（p=0.0085，n=22/21）；结核裂解物刺激后，BCG接种婴儿Vδ1/3 T细胞表达颗粒酶B的频率平均为1%，脐带血组为0%（p=0.0025，n=22/21），干扰素-γ表达水平平均比脐带血组高12倍（p<0.0001，n=22/21），肿瘤坏死因子表达中位数频率脐带血组是BCG接种组的2倍（p=0.0037，n=22/21），CD107a和颗粒酶K的频率两组无显著差异，结果证实BCG接种婴儿Vδ1/3 T细胞在结核抗原刺激下颗粒酶B和干扰素-γ产生增加，具有更强的抗菌效应功能。

实验所用产品：领域常规使用流式细胞术相关试剂与仪器，无特殊品牌产品。

3.3 恒河猴静脉BCG接种后γδT细胞单细胞转录组分析

实验目的：明确静脉BCG接种后恒河猴外周血和气道中Vδ1/3 T细胞的转录组动态变化特征。方法细节：纳入4只静脉BCG接种的印度来源恒河猴，分别采集接种前、接种后4周、接种后8周的外周血单个核细胞以及支气管肺泡灌洗细胞，分选γδT细胞后进行多模态单细胞RNA测序和TCR测序，整合分析不同时间、不同组织中Vδ1/3 T细胞的基因表达差异。结果解读：共获得12777个高质量γδT细胞，聚类得到12个细胞亚群，Vδ1/3 T细胞分布于所有12个亚群，Vγ9Vδ2 T细胞占比不到1%。差异基因分析显示，与接种前相比，接种后4周和8周外周血Vδ1/3 T细胞下调幼稚相关基因，上调细胞毒性效应基因和T细胞激活相关基因；支气管肺泡灌洗中的Vδ1/3 T细胞除表达细胞毒性相关特征外，还高表达组织驻留相关基因、近期TCR激活相关基因以及已被证实与结核控制相关的TNFSF8，说明BCG接种后外周血和气道中的Vδ1/3 T细胞都获得了抗菌和细胞毒性效应程序。

实验所用关键产品：10x Genomics的Chromium Next GEM Single Cell 5′ Reagent kit (v2)、Illumina的NextSeq 500测序系统，其余为领域常规试剂与仪器。

3.4 恒河猴Vδ1/3 T细胞功能应答特征验证

实验目的：通过流式细胞术验证静脉BCG接种后Vδ1/3 T细胞对结核抗原的功能应答，明确应答的时间动态和组织分布特征。方法细节：纳入16只静脉BCG接种的恒河猴，分别在接种前、接种后2周、4周、8周采集外周血，接种后8周采集支气管肺泡灌洗，以9只未接种恒河猴的支气管肺泡灌洗作为对照，结核全细胞裂解物刺激后，流式检测Vδ1/3 T细胞激活、细胞毒性和细胞因子标志物的表达，比较不同时间、不同组织以及接种组和对照组的差异，同时与Vγ9Vδ2 T细胞和CD8 T细胞的应答峰值进行比较。结果解读：结核抗原刺激后，BCG接种后外周血Vδ1/3 T细胞表达CD137的频率最高增加6倍（p<0.0001，n=16），气道中增加10倍（p=0.0024，n=16/9）；外周血中表达颗粒酶的频率从基线0%升高到8周的8.7%（p=0.043，n=16），CD107a表达在外周血最高增加8倍（p=0.0009，n=16），气道中增加50倍（p=0.0057，n=16/9）；干扰素-γ或肿瘤坏死因子表达频率在外周血升高超过20倍（p=0.0011，n=16），气道中升高超过40倍（p=0.0006，n=16/9）。BCG接种后，气道中结核反应性Vδ1/3 T细胞频率平均比外周血富集13倍（p=0.0002，n=16），细胞因子产生Vδ1/3 T细胞频率平均富集超过10倍（p=0.0001，n=16），未接种动物无此差异。进一步比较发现，Vδ1/3 T细胞的功能应答峰值出现在接种后2周，早于传统CD8 T细胞的应答峰值（4-8周），证实静脉BCG可以增强Vδ1/3 T细胞对结核抗原的细胞毒性和促炎应答，且应答时间早于传统CD8 T细胞。

实验所用关键产品：BD Biosciences的BD LSRFortessa流式细胞仪，其余为领域常规试剂。

3.5 Vδ1/3 T细胞克隆扩增与TCR依赖性分析

实验目的：明确静脉BCG接种后Vδ1/3 T细胞是否发生克隆扩增，以及效应功能是否依赖TCR信号。方法细节：对4只恒河猴接种前、接种后4周、8周的γδT细胞进行单细胞TCR测序，分析克隆扩增的频率和分布，同时分离接种后不同时间的PBMC，在结核裂解物刺激时加入TCR信号抑制剂环孢素A，检测Vδ1/3 T细胞功能应答的变化。结果解读：接种后4周和8周，分别检测到9个和10个Vδ1/3克隆型发生扩增，所有动物接种后4周扩增克隆型占Vδ1/3 TCR库的比例都比接种前升高；扩增的Vδ1/3克隆型主要分布在细胞毒性亚群，高表达颗粒酶A等细胞毒性相关基因，且扩增克隆型具有组织特异性，外周血扩增的克隆型在气道中均未检测到。环孢素A处理后，结核裂解物刺激下Vδ1/3 T细胞的CD137和干扰素-γ表达减少约90%，证实效应功能依赖TCR信号，并非旁观者激活。结果说明BCG诱导Vδ1/3 T细胞发生TCR依赖的克隆扩增，扩增的克隆型具有细胞毒性功能。

实验所用关键产品：Sigma Aldrich的环孢素A，其余为领域常规试剂与仪器。

3.6 Vδ1/3 T细胞与抗结核保护的相关性分析

实验目的：明确气道中Vδ1/3 T细胞的频率和功能是否与BCG接种后的抗结核保护相关。方法细节：利用已发表的34只静脉BCG接种恒河猴结核攻毒实验数据，重新分析原始流式文件，以尸检总胸部结核菌落数<100定义为保护组（n=18），≥100定义为非保护组（n=16），比较两组气道中Vδ1/3 T细胞的频率和抗原刺激后细胞因子产生频率，通过相关性分析和校正模型排除BCG剂量等混杂因素的影响，验证其与保护的独立性。结果解读：保护组接种后2周（p=0.027，n=18/16）和8周（p=0.046，n=18/16）气道Vδ1/3 T细胞频率比非保护组高1.5-2倍，接种后4周保护组气道中产生干扰素-γ、IL-2或肿瘤坏死因子的Vδ1/3 T细胞频率比非保护组高2倍（p=0.0091，n=18/16）。校正BCG剂量和队列混杂因素后，气道Vδ1/3 T细胞计数仍然是保护的显著相关因素，相关性强度与已报道的最强T细胞保护相关因素相当，且不依赖已有的已知保护相关因素。说明气道Vδ1/3 T细胞的频率和功能与静脉BCG诱导的抗结核保护显著相关。

实验所用产品：基于已有发表数据进行重新分析，无新实验产品。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究发现的潜在生物标志物为气道Vδ1/3 T细胞（Vγ9阴性γδT细胞，推断96%为Vδ1/3 T细胞）以及结核抗原反应性细胞因子产生Vδ1/3 T细胞，筛选验证逻辑为：首先在人婴儿BCG接种模型中通过单细胞测序发现BCG诱导Vδ1/3 T细胞激活和细胞毒性功能，流式验证功能差异，随后在恒河猴静脉BCG接种模型中重复验证克隆扩增、TCR依赖和功能特征，最后结合大样本恒河猴结核攻毒数据，通过组间比较和校正模型验证其与保护的相关性，逻辑链条完整。

研究过程中，Biomarker来源于恒河猴支气管肺泡灌洗的气道样本，验证方法为流式细胞术检测Vγ9阴性γδT细胞频率，以及结核纯化蛋白衍生物刺激后细胞因子产生频率，统计学分析结果显示，保护组与非保护组比较，接种后2周Vδ1/3 T细胞频率差异p=0.027（n=18/16），接种后4周细胞因子阳性Vδ1/3 T细胞频率差异p=0.0091（n=18/16），接种后8周Vδ1/3 T细胞频率差异p=0.046（n=18/16），校正BCG剂量和队列因素后，该相关性仍然具有统计学显著性，相关性强度与已报道的最强抗结核保护相关因素相当。

核心成果提炼：本研究首次在两种独立的BCG保护模型中证实，BCG接种可以诱导Vδ1/3 T细胞发生TCR依赖的克隆扩增，获得细胞毒性和促炎效应功能，首次发现气道中Vδ1/3 T细胞的频率和抗原反应性细胞因子产生能力与结核攻毒后的保护效果显著相关，是BCG诱导抗结核保护的新型独立生物标志物（n=34，校正后p<0.05）。该发现扩展了BCG诱导保护性免疫的相关细胞谱，为新型结核疫苗的研发提供了新的靶点，也为疫苗保护效果的评价提供了新的标志物，具有重要的学术和应用价值。