双靶向 CD133/PD-L1 CAR-T 加 αPD-1 可克服免疫抑制微环境，并可通过放射预处理增强疗效。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Dual-targeting CD133/PD-L1 CAR-T plus αPD-1 overcomes immunosuppressive microenvironment and enhanced by radiation pre-conditioning；
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：实体瘤CAR-T细胞免疫治疗。

领域共识：过继性细胞转移疗法中的CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了突破性进展，但其在实体瘤中的应用仍面临多重挑战。目前阻碍CAR-T治疗实体瘤转化应用的主要障碍包括：靶点选择有限、肿瘤微环境免疫抑制、CAR-T细胞浸润不足、持久性差等。CD133是多种实体恶性肿瘤中高表达的肿瘤干细胞标志物，被认为是CAR-T治疗的理想靶点；而PD-1/PD-L1轴是肿瘤免疫逃逸中关键的抑制性信号通路，靶向该通路的嵌合转换受体可增强CAR-T细胞疗效。已有研究构建了针对PD-L1和其他肿瘤抗原的双靶向CAR-T细胞，在实体瘤治疗中展现出更好的疗效，放疗可通过多种机制增强免疫治疗效果，放疗与PD-1/PD-L1阻断的协同作用已被多项研究和临床试验证实，放疗预处理有望增强CAR-T细胞的肿瘤浸润能力。

目前针对CD133的第二代CAR-T细胞临床疗效有限，同时PD-L1单靶点阻断不足以完全解除免疫抑制，且CAR-T细胞浸润不足、持久性差的问题仍未得到解决，缺乏将放疗、双靶向CAR-T与PD-1阻断联合的多模式治疗策略的系统研究。因此本研究针对这些问题，构建了新型双靶向CD133/PD-L1 CAR-T细胞，并探索联合PD-1阻断与放疗预处理的抗肿瘤效果，为克服实体瘤CAR-T治疗的现有障碍提供新的策略。

2. 文献综述解析

本研究作者从靶点选择、免疫抑制微环境、CAR-T浸润三个关键限制因素对现有研究进行梳理分类。首先，在靶点选择层面，现有研究已经证实CD133作为肿瘤干细胞标志物，在结直肠癌、肝细胞癌、胃癌等多种实体瘤中高表达，靶向CD133的CAR-T是可行的治疗方向，但单抗原靶向的CAR-T在实体瘤中疗效不足，需要升级优化。其次，在克服免疫抑制微环境层面，现有研究明确PD-1/PD-L1轴在肿瘤免疫抑制中发挥核心作用，靶向该轴的嵌合转换受体可将抑制性信号逆转为阳性共刺激信号，同时还可直接杀伤PD-L1阳性肿瘤细胞，多个研究构建的双靶向CAR-T已经显示出增强的抗肿瘤效果，说明优化CAR-T的PD-L1/PD-1信号是克服免疫抑制微环境的重要方向，但现有双靶向CAR-T多携带两个CD3ζ链，载体体积大，转染效率存在提升空间。最后，在解决CAR-T浸润不足问题层面，现有研究证实CAR-T细胞浸润不足是限制实体瘤CAR-T疗效的重要因素，放疗可通过增加肿瘤抗原性、刺激免疫激活、调节血管、改变细胞因子谱等方式增强免疫治疗效果，放疗与PD-1/PD-L1阻断的协同作用也得到了广泛验证，放疗联合CAR-T是很有前景的研究方向，但放疗与CAR-T联合的具体机制尚不明确。

本研究的创新点在于首次构建了共享单个CD3ζ链的新型双靶向CD133/PD-L1 CAR-T，发现了CD28结构介导的旁观者激活效应，减少了载体体积，为双CAR-T设计提供了新的思路；同时本研究系统验证了放疗预处理+双靶向CAR-T+PD-1阻断三联疗法的抗肿瘤效果，明确了放疗诱导肿瘤细胞E-钙粘蛋白上调促进CD103+CXCR6+组织驻留记忆CAR-T细胞形成的分子机制，填补了多模式联合治疗实体瘤CAR-T研究的空白，为临床转化提供了新的方向。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标是开发可克服实体瘤免疫抑制微环境的新型双靶向CAR-T，探索联合PD-1阻断和放疗预处理的多模式治疗策略提升抗肿瘤效果，核心科学问题是双靶向CAR-T的新型激活机制、多模式联合的抗肿瘤效果及潜在分子机制，技术路线为：新型双CAR载体构建→体外激活机制与功能验证→动物模型体内药效验证→单细胞测序探索机制→临床样本验证结论，形成了完整的研究闭环。

3.1 双靶向CAR-T设计与激活机制验证

实验目的：验证新型双靶向CD133/PD-L1 CAR-T的激活机制与体外激活功能。
方法细节：构建了包含αPDL1.28/αCD133.28ζ、αPDL1.BB/αCD133.28ζ、αPDL1.28/αCD133.BBζ在内的多种双CAR结构的慢病毒载体，通过慢病毒转染健康供体来源CD3+T细胞制备不同的CAR-T，通过流式细胞术检测CAR表达，PD-L1抗原刺激24小时后检测激活标志物比例和干扰素-γ释放，荧光素杀伤实验检测对CD133-/PD-L1+肿瘤细胞的杀伤能力，利用绿色荧光蛋白和mCherry分别标记两个CAR，通过共聚焦显微镜观察CAR的聚集与共定位。
结果解读：流式细胞术结果显示，只有αPDL1.28/αCD133.28ζ CAR-T在单独PD-L1刺激后，CD69/4-1BB阳性细胞比例升高，干扰素-γ释放显著增加（n=3，P<0.01），且对CD133阴性PD-L1阳性肿瘤细胞也具有杀伤功能，在不同效靶比下杀伤效率均显著高于其他组（P<0.05）。共聚焦显微镜图显示，PD-L1刺激后，αPDL1.28和αCD133.28ζ发生膜聚集和共定位。说明含有相同CD28铰链、跨膜和胞内结构域的两个CAR可以通过CD28二聚化聚集，使结合PD-L1的αPDL1.28共享CD133 CAR的CD3ζ链传递激活信号，产生旁观者激活效应。
实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用慢病毒包装系统、流式检测抗体、共聚焦显微镜。

3.2 双靶向CAR-T体外与体内抗肿瘤活性验证

实验目的：验证双靶向CAR-T对CD133+肿瘤细胞的杀伤能力。
方法细节：构建了不同基础PD-L1表达的CD133+肿瘤细胞系，将αPDL1.28/αCD133.28ζ CAR-T、单靶向αCD133.28ζ CAR-T和对照T细胞分别与肿瘤细胞按效靶比1:1共培养24小时，检测激活标志物比例、细胞因子释放和杀伤效率，在患者来源CD133+PD-L1-肺癌类器官中验证杀伤效果，最后在免疫缺陷NCG小鼠皮下接种肿瘤构建异种移植模型，评估体内抗肿瘤效果和T细胞浸润。
结果解读：共培养结果显示，与单靶向CAR-T相比，αPDL1.28/αCD133.28ζ CAR-T的激活标志物（4-1BB、CD69、CD25）比例更高（n=3，P<0.05），干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-2释放更多，在不同效靶比下对CD133+肿瘤细胞的杀伤能力更强，且不受基础PD-L1表达水平影响（P<0.01）。类器官实验显示，双靶向CAR-T对肺癌类器官的杀伤更显著，干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α释放更高（n=3，P<0.001）。体内实验显示，双靶向CAR-T显著延缓了PD-L1野生型和过表达模型的肿瘤生长（P<0.01），肿瘤组织中T细胞比例也高于单靶向CAR-T和对照组（P<0.05）。说明双靶向CAR-T比单靶向CD133 CAR-T具有更强的抗肿瘤细胞毒性，无论肿瘤基础PD-L1表达如何都有效，但单独双靶向CAR-T不足以完全清除肿瘤。
实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用细胞培养试剂、流式检测试剂、荧光素酶检测系统、类器官培养试剂。

3.3 PD-1阻断联合治疗增强效果验证

实验目的：探索PD-1阻断是否能增强双靶向CAR-T的抗肿瘤活性，尤其是PD-L1过表达肿瘤模型。
方法细节：共培养实验检测CAR-T处理后肿瘤细胞PD-L1表达变化，在PD-L1敲除肿瘤模型中验证双靶向CAR-T的活性，然后进行多轮共培养实验，联合PD-1抗体替雷利珠单抗处理，最后在小鼠双侧异种移植肿瘤模型中评估体内疗效。
结果解读：共培养后，双靶向CAR-T处理组的肿瘤细胞PD-L1表达更低，说明双靶向CAR-T可同时清除CD133+和PD-L1+肿瘤亚克隆；而在PD-L1敲除肿瘤模型中，双靶向CAR-T的增强抗肿瘤活性消失，说明其活性依赖PD-L1存在。在PD-L1过表达肿瘤模型中，肿瘤细胞表面持续存在高PD-L1表达，会通过CAR-T细胞表面PD-1受体产生过度抑制，联合替雷利珠单抗后，多轮共培养实验中残存肿瘤细胞数量显著减少（P<0.0001），体内实验中双侧肿瘤均达到完全缓解。说明PD-1阻断可显著增强双靶向CAR-T的抗肿瘤免疫，尤其对PD-L1过表达肿瘤有效。
实验所用关键产品：抗PD-1抗体替雷利珠（百济神州）。

3.4 放疗预处理联合治疗效果验证

实验目的：探索放疗预处理是否能进一步协同增强CAR-T治疗，评估三联疗法的效果与安全性。
方法细节：首先检测放疗后肿瘤细胞表面CD133和PD-L1表达，通过Transwell实验检测放疗对CAR-T迁移能力的影响，然后在高肿瘤负荷（约200mm3）小鼠模型中分别检测不同组合方案的疗效，长期监测肿瘤生长、小鼠生存、外周血CAR-T拷贝数和细胞因子水平。
结果解读：体外实验显示，放疗后肿瘤细胞表面CD133和PD-L1表达升高，Transwell实验显示CAR-T向放疗后的肿瘤细胞迁移显著增加（P<0.05）。体内实验显示，10Gy单次放疗联合CAR-T比单独CAR-T的肿瘤控制更好，生存期更长；而放疗+双靶向CAR-T+PD-1阻断三联疗法达到了完全肿瘤消退，且抗肿瘤免疫记忆可持续超过100天，耐受性良好，无明显脱靶器官毒性。外周血检测显示，三联疗法组在所有时间点的CAR-T拷贝数都高于其他组（P<0.05），PD-1联合组的干扰素-γ水平更高，而放疗预处理降低了外周细胞因子水平，提示可降低细胞因子释放综合征风险。
实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用X射线辐照仪、流式细胞术、定量PCR仪。

3.5 三联疗法诱导组织驻留记忆CAR-T的机制探索

实验目的：探索三联疗法抗肿瘤效果的分子机制，明确放疗影响CAR-T功能的具体通路。
方法细节：对治疗17天后的小鼠肿瘤组织进行单细胞RNA测序，分群鉴定CAR-T亚群，通过拟时序分析分析CAR-T的动态演化过程，通过流式细胞术和多重免疫荧光染色验证目标亚群比例，进一步通过转录组分析找到放疗后差异富集通路，在临床小细胞肺癌样本中通过单细胞测序验证放疗对E-钙粘蛋白-CD103相互作用的影响。
结果解读：单细胞RNA测序结果显示，放疗+CAR-T和放疗+CAR-T+PD-1组的CAR-T/肿瘤比例显著升高，其中CD8+CXCR6+T细胞亚群高表达ITGAE（编码CD103）和CXCR6，基因集富集分析显示该亚群与已报道的组织驻留记忆T细胞特征高度相似，因此确定为CD8+组织驻留记忆CAR-T细胞（CD103+CXCR6+CAR-Trm）。拟时序分析显示，该亚群由循环CD8+T细胞分化而来，放疗组该亚群比例显著升高，流式和免疫荧光也验证了三联治疗组CD103+CXCR6+CD8+Trm比例显著高于未放疗组（P<0.05）。转录组分析显示，放疗组肿瘤细胞上调的差异基因稳定富集在钙粘蛋白结合信号通路，CDH1（编码E-钙粘蛋白）持续上调，E-钙粘蛋白是CD103的经典配体，空间分布分析显示CD103+CXCR6+CD8+Trm细胞更靠近E-钙粘蛋白阳性肿瘤细胞，体外实验也验证放疗上调肿瘤细胞表面E-钙粘蛋白表达，共培养后CD103+CXCR6+CD8+Trm比例更高（P<0.05）。临床样本单细胞测序也证实，放疗后小细胞肺癌细胞CDH1表达显著升高（P<0.05），上调基因富集在钙粘蛋白结合通路，放疗增强了肿瘤细胞和CD8+T细胞之间的E-钙粘蛋白-CD103相互作用。说明放疗通过诱导肿瘤细胞E-钙粘蛋白上调，促进了CD103+CXCR6+CAR-Trm细胞的分化和维持，从而增强了抗肿瘤持久性。
实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用单细胞测序建库试剂盒、高通量测序平台、多重免疫荧光染色试剂。

4. Biomarker研究及发现成果解析

本研究涉及的生物标志物包括肿瘤靶标CD133、PD-L1，以及肿瘤微环境中CAR-T亚群标志物CD103、CXCR6和配体E-钙粘蛋白。CD133作为CAR-T核心靶标，筛选验证逻辑为：首先通过组织芯片验证CD133在结直肠癌、肝癌等多种实体瘤中高表达，随后在细胞系、患者来源类器官、动物模型中逐步验证靶向CD133的有效性，最后在动物模型和临床样本中验证放疗后CD133表达上调，增强CAR-T识别。PD-L1作为第二靶标，验证逻辑为：体外验证不同PD-L1表达水平下双靶向CAR-T的疗效，验证PD-L1敲除后双靶向CAR-T的增强活性丧失，体内验证PD-L1过表达模型中PD-1联合治疗的必要性。CD103和CXCR6是CD103+CXCR6+组织驻留记忆CAR-T细胞的特征标志物，E-钙粘蛋白是该细胞亚群相互作用的配体，验证逻辑为：单细胞测序发现该亚群后，通过流式细胞术、多重免疫荧光染色验证不同治疗组的亚群比例差异，转录组分析找到放疗后CDH1上调，体外实验和临床样本验证放疗上调E-钙粘蛋白，增强E-钙粘蛋白与CD103的相互作用。

本研究中CD133来源于实体肿瘤组织，通过免疫组化验证组织芯片中CD133的表达，通过流式细胞术验证肿瘤细胞系表面CD133表达。PD-L1表达通过流式细胞术检测，在共培养后检测不同CAR-T处理组的PD-L1表达变化。CD103、CXCR6通过单细胞RNA测序、流式细胞术、多重免疫荧光染色检测表达比例，E-钙粘蛋白通过流式、免疫荧光、转录组测序检测其表达变化，通过空间分布分析验证CD103+Trm与E-钙粘蛋白阳性肿瘤细胞的距离。在小鼠模型中，三联疗法后外周血CAR-T拷贝数在第10天达到峰值，且所有时间点都高于其他分组（P<0.05，n=6），放疗预处理后血清干扰素-γ水平降低（n=6，P<0.05）。临床小细胞肺癌样本中，放疗组肿瘤细胞CDH1表达显著高于未放疗组（P<0.05，n=2例放疗/2例未放疗），放疗后CD8+CXCR6+Trm比例升高。

核心成果：本研究明确了CD133作为实体瘤CAR-T治疗靶标的有效性，证实双靶向CD133/PD-L1 CAR-T无论肿瘤基础PD-L1表达如何，都具有更强的抗肿瘤细胞毒性，小鼠异种移植模型中，双靶向CAR-T治疗组肿瘤生长风险比HR=0.32（P=0.002），PD-1联合阻断可进一步增强疗效，尤其在PD-L1过表达肿瘤中（P<0.001）。本研究首次发现放疗预处理可诱导肿瘤细胞上调E-钙粘蛋白，促进肿瘤微环境中CD103+CXCR6+组织驻留记忆CAR-T细胞的分化和维持，该亚群与长期抗肿瘤免疫记忆相关，三联疗法可实现完全肿瘤消退，小鼠生存期延长超过100天（P<0.0001，n=8），且可降低细胞因子释放综合征风险。此外，本研究首次报道了双CAR通过CD28二聚化共享CD3ζ链的新型激活机制，可减少载体体积，提升转染效率，为下一代双CAR-T设计提供了新的思路。