pH调节剂碘油Pickering乳剂通过诱导铁死亡和激活抗肿瘤免疫来增强经动脉栓塞疗法。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：pH-regulating Lipiodol Pickering emulsions enhance transarterial embolization therapy via inducing ferroptosis and activating antitumor immunity；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：肝细胞癌经动脉栓塞治疗，功能性栓塞材料开发。

领域共识：肝细胞癌占所有肝癌病例的80%~85%，是全球第六大常见恶性肿瘤，对于无法手术切除的患者，经导管动脉化疗栓塞（TACE）是最常用的局部治疗手段。传统TACE使用普通碘油和聚合物微球作为化疗药物载体，通过缺血效应和细胞毒效应杀伤肿瘤，但临床疗效仍不理想，核心问题包括栓塞不完全、药物释放失控，且动脉栓塞会进一步加重肿瘤缺氧和酸化，促进免疫抑制性肿瘤微环境形成，降低治疗应答。

近年来，开发具有优化药代动力学特性和肿瘤微环境调控能力的新一代栓塞材料是提升TACE疗效的研究热点。肿瘤细胞存在瓦伯格效应，会产生大量乳酸，通过高表达钠氢交换体1（NHE1）将质子泵出细胞，形成细胞内碱性、细胞外酸性的异常pH梯度，这种肿瘤特异性酸度不仅会降低多种治疗手段的疗效，还成为了新兴的治疗靶点。现有研究已探索出两类酸度调控策略，一类是使用质子转运抑制剂直接诱导细胞内酸化，另一类是使用碳酸钙制剂中和细胞外酸性，两类策略都显示出一定的疗效增强效果，但单一策略的抑癌作用有限，同时调控细胞内和细胞外酸度发挥协同抗肿瘤效应的研究仍存在空白。

本研究针对该研究空白，开发了载带NHE1抑制剂卡立泊来德的铁纳米颗粒稳定碘油Pickering乳液，探索其通过pH调控协同增强铁死亡诱导和抗肿瘤免疫激活的效果，为肝细胞癌TACE治疗提供新的候选方案，对功能性栓塞材料开发具有重要的范式参考价值。

2. 文献综述解析

作者将现有研究按研究方向分为三类梳理，分别是传统TACE栓塞材料研究、新型酸度调控肿瘤治疗研究、铁死亡诱导治疗研究。对于传统TACE栓塞材料，现有研究证实这类材料技术成熟、成本较低，已在临床广泛应用，但普遍存在稳定性差、药物释放不可控、栓塞不彻底的缺陷，且治疗后会加重肿瘤微环境酸化和免疫抑制，整体客观缓解率有待提升，无法满足临床需求。对于肿瘤异常pH调控的研究，现有研究分别验证了质子转运抑制剂诱导细胞内酸化、碱性制剂中和细胞外酸性的有效性，证实肿瘤酸度是可干预的治疗靶点，但两类策略都是单独应用，未探索二者的协同效应，也未与栓塞治疗结合发挥局部治疗联合免疫治疗的作用。对于铁死亡诱导治疗研究，现有研究已经明确亚铁离子催化的芬顿反应可通过诱导细胞内脂质过氧化有效触发铁死亡，而芬顿反应的效率依赖酸性环境，细胞内酸化可显著提升芬顿反应效率，这为酸度调控联合铁死亡诱导提供了理论基础，但该协同机制尚未应用于TACE栓塞材料的开发。

通过对现有研究的梳理，本研究的创新价值十分明确，首次将pH响应性铁纳米颗粒、NHE1抑制剂卡立泊来德整合到碘油Pickering乳液体系中，实现了“细胞内酸化增强芬顿反应+细胞外碱化逆转免疫抑制微环境”的双重调控，同时发挥栓塞、铁死亡杀伤、免疫激活三重作用，弥补了现有栓塞材料功能单一的不足，为下一代TACE栓塞材料的设计提供了新的思路。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标为开发可同时调控肿瘤pH、诱导铁死亡并激活抗肿瘤免疫的新型经动脉栓塞材料，提升肝细胞癌TACE治疗疗效；核心科学问题是同时调控细胞内和细胞外肿瘤酸度能否协同增强芬顿反应诱导的铁死亡，进而激活系统性抗肿瘤免疫，最终提升栓塞治疗效果；技术路线遵循“材料合成表征→细胞水平机制验证→皮下瘤体内药效验证→免疫微环境调控分析→原位肝癌经动脉给药验证”的完整闭环，逻辑清晰，证据链完整。

3.1 CFe-LPE的制备与表征

实验目的：合成卡立泊来德载带的铁纳米颗粒稳定碘油Pickering乳液（CFe-LPE），表征其理化性质、pH响应性和可注射性，验证其作为栓塞材料的可行性。

方法细节：采用硼氢化钠还原三氯化铁合成铁纳米颗粒，合成后立即用辛酸钠进行表面修饰防止铁纳米颗粒氧化；将修饰后的铁纳米颗粒分散于碘油，再与溶解了卡立泊来德的水相混合，通过三通挤出制备得到CFe-LPE；采用透射电子显微镜、X射线衍射、接触角测量、溶血实验验证铁纳米颗粒的基本性质和生物相容性；通过不同pH条件下的铁离子释放检测、亚甲基蓝脱色实验验证铁纳米颗粒的pH响应性芬顿催化能力；通过相分离观察、包封率检测验证乳液稳定性；通过药物释放实验、粘度检测、注射力测量验证CFe-LPE的pH响应性药物释放和经导管注射适用性。

结果解读：透射电子显微镜观察显示合成的铁纳米颗粒为球形，直径分布在20~40nm（文献未明确提供该数据样本量，基于图表趋势推测）；X射线衍射分析证实其为无定形结构；表面修饰后铁纳米颗粒的接触角从不修饰的39.7°升高至约102.5°，符合稳定水包油Pickering乳液的最优范围90°~110°；溶血实验显示铁纳米颗粒浓度最高为200μg/mL时，溶血率小于2%（n=3，文献未明确提供P值），证明材料具有良好的生物相容性；pH依赖性降解实验证实，pH5.4的酸性条件下铁纳米颗粒释放亚铁离子的效率显著高于中性pH条件（n=3，文献未明确提供P值）；亚甲基蓝脱色实验进一步证实，酸性条件下铁纳米颗粒催化过氧化氢生成羟基自由基的效率最高，符合pH响应性芬顿催化剂的特性；未添加铁纳米颗粒的传统碘油乳液在挤出后5min内就发生相分离，添加铁纳米颗粒后乳液稳定性显著提升，卡立泊来德的包封率达到约97.6%，符合载药要求；pH响应性药物释放实验显示，pH6.5条件下卡立泊来德的释放速度显著快于pH7.4条件（n=3，文献未明确提供P值），符合肿瘤微环境响应释放的设计；流变学检测显示CFe-LPE在300s-1剪切速率下粘度为0.233 Pa·s，与纯碘油相近；通过2.8F微导管的注射力为12.6N，与纯碘油的9N相近，满足经导管动脉栓塞操作的注射要求。

实验所用关键产品：文献未提及核心材料的品牌信息，领域常规使用氯化铁、硼氢化钠、辛酸钠、卡立泊来德等化学试剂，以及透射电子显微镜、X射线衍射仪、旋转流变仪等常规仪器。

3.2 细胞水平协同铁死亡诱导与免疫激活验证

实验目的：在细胞水平验证卡立泊来德与铁纳米颗粒协同诱导肿瘤细胞铁死亡，以及铁死亡触发后激活抗肿瘤免疫的效应。

方法细节：以大鼠肝癌N1S1细胞为模型，采用电感耦合等离子体发射光谱检测细胞对铁纳米颗粒的摄取动力学；采用透膜性BCECF-AM荧光探针检测细胞内pH变化，采用非透膜性BCECF检测细胞外pH变化，验证卡立泊来德的pH调控效果；分别采用特异性荧光探针检测细胞内羟基自由基、活性氧和脂质过氧化水平，检测脂质过氧化产物丙二醛含量和铁死亡关键酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的活性；采用细胞活力实验结合不同类型细胞死亡抑制剂，验证联合处理诱导细胞死亡的类型；通过免疫荧光染色检测损伤相关分子模式钙网蛋白和高迁移率族蛋白B1的表达，验证免疫原性细胞死亡特征；进一步通过共孵育实验检测处理后的肿瘤细胞对骨髓来源树突状细胞成熟的促进作用，以及对抗原特异性T细胞增殖和促炎细胞因子分泌的激活作用。

结果解读：N1S1细胞与铁纳米颗粒孵育后，细胞内铁含量呈时间依赖性升高（n=3，文献未明确提供P值）；卡立泊来德处理后细胞内pH呈浓度依赖性降低，同时显著升高细胞外pH，铁纳米颗粒单独处理不会改变细胞内外pH，卡立泊来德联合铁纳米颗粒处理的pH变化与卡立泊来德单独处理一致（n=5，P<0.05），证实卡立泊来德通过抑制NHE1介导的质子外排，同时诱导细胞内酸中毒和细胞外碱化；联合处理组细胞内羟基自由基和活性氧生成量显著高于单药处理组，脂质过氧化水平最高，丙二醛含量最高，GPX4活性显著降低（n=5，P<0.001）；加入铁死亡抑制剂Fer-1后，联合处理诱导的脂质过氧化显著减弱，细胞活力从19.9%升高至72.3%（n=5，P<0.0001），而凋亡、坏死性凋亡、焦凋亡抑制剂对联合处理的细胞毒性无显著影响，证实卡立泊来德与铁纳米颗粒主要通过铁死亡诱导肿瘤细胞死亡；联合处理后的肿瘤细胞钙网蛋白表达显著升高，高迁移率族蛋白B1核释放增加，能更有效促进骨髓来源树突状细胞成熟，显著增强抗原特异性T细胞增殖，干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α分泌水平显著升高（n=3，P<0.01），证实铁死亡可诱导免疫原性细胞死亡，具备激活抗肿瘤免疫的潜能。

实验所用关键产品：实验所用关键产品：ABclonal的谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒、脂质过氧化丙二醛检测试剂盒（碧云天），其余未提及具体品牌，领域常规使用共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞仪等仪器。

3.3 皮下H22肿瘤模型体内药效与机制验证

实验目的：验证CFe-LPE在体内的肿瘤滞留能力、pH调控能力、铁死亡诱导效果和整体抑癌疗效，并明确铁死亡和抗肿瘤免疫对疗效的贡献。

方法细节：建立BALB/c小鼠皮下H22肝癌模型，分为PBS、卡立泊来德载带传统碘油乳液、铁纳米颗粒稳定碘油乳液、阿霉素载带传统碘油乳液、CFe-LPE五组进行瘤内注射；采用活体荧光成像评估CFe-LPE的肿瘤滞留能力；通过离体荧光成像和共聚焦显微镜检测治疗后肿瘤的细胞内、细胞外pH变化；采用免疫荧光染色检测肿瘤内脂质过氧化水平和GPX4表达；持续监测肿瘤生长、小鼠体重和生存期，通过组织染色评估肿瘤损伤和增殖情况；分别通过铁死亡抑制剂处理和免疫缺陷裸鼠模型，验证铁死亡和抗肿瘤免疫对整体疗效的贡献。

结果解读：注射后48h，CFe-LPE组肿瘤区域仍保留73.9%的Cy5.5标记信号，而传统碘油乳液组信号已基本消失，证实CFe-LPE具有 prolonged的肿瘤滞留效果，可持续释放药物（n=3，文献未明确提供P值）；CFe-LPE处理后肿瘤细胞内pH显著低于其他组，细胞外pH显著高于其他组，与细胞实验结论一致（n=3，P<0.0001）；CFe-LPE处理组肿瘤脂质过氧化水平显著高于其他组，GPX4表达显著低于其他组，证实在体内可高效诱导铁死亡；CFe-LPE处理的肿瘤生长抑制效果最强，中位生存期达到28天，显著长于PBS组的14天、阿霉素传统乳液组的22天（n=5，P<0.01），所有处理组小鼠体重均无显著变化，证明CFe-LPE无明显全身毒性；组织染色显示CFe-LPE处理组肿瘤组织损伤最严重，Ki67增殖阳性率最低；铁死亡抑制剂Fer-1处理后，CFe-LPE的肿瘤抑制效果部分减弱，中位生存期缩短；在免疫缺陷裸鼠中CFe-LPE的抑癌效果与阿霉素传统乳液相近，而在免疫正常小鼠中疗效显著优于阿霉素传统乳液，证实CFe-LPE的疗效依赖于铁死亡诱导和后续抗肿瘤免疫激活的协同作用。

3.4 肿瘤免疫微环境调控分析

实验目的：通过转录组和流式细胞术明确CFe-LPE对肿瘤免疫微环境的调控作用。

方法细节：收集PBS处理和CFe-LPE处理的H22肿瘤组织进行转录组测序，分析差异表达基因的富集通路；采用流式细胞术检测治疗后肿瘤引流淋巴结树突状细胞成熟比例，以及肿瘤内各类免疫细胞的浸润比例；采用酶联免疫吸附实验检测肿瘤组织内的细胞因子分泌水平。

结果解读：与对照组相比，CFe-LPE处理组共获得940个差异表达基因，其中910个上调，30个下调；差异表达基因显著富集到先天/适应性抗肿瘤免疫激活、活性氧代谢、铁死亡相关生物学过程和信号通路，从转录组层面确认了CFe-LPE诱导铁死亡和激活免疫的效应；CFe-LPE处理显著促进引流淋巴结中树突状细胞成熟，肿瘤内CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例升高，免疫抑制性调节性T细胞比例降低，CD3+CD8+T细胞/调节性T细胞比值达到10.1，显著高于其他对照组（n=5，P<0.001）；同时肿瘤内细胞毒性自然杀伤细胞比例升高，促进巨噬细胞从抗炎M2型极化为促炎M1型；肿瘤组织中促炎细胞因子IL-12p70、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ分泌水平显著升高，抗炎细胞因子IL-10水平显著降低（n=5，P<0.05），证实CFe-LPE可以有效逆转免疫抑制性肿瘤微环境，同时激活固有和适应性抗肿瘤免疫应答。

3.5 原位肝癌模型经动脉栓塞疗效与安全性验证

实验目的：验证CFe-LPE经动脉给药后，在原位肝癌模型中的栓塞疗效和生物安全性，评估临床转化潜力。

方法细节：分别建立Sprague-Dawley大鼠原位N1S1肝癌模型和新西兰兔原位VX2肝癌模型，在数字减影血管造影引导下经动脉分组给药，分为PBS、铁纳米颗粒稳定碘油乳液、阿霉素传统碘油乳液、CFe-LPE四组；采用离体荧光成像验证CFe-LPE经动脉给药后的肿瘤选择性滞留；通过超声、正电子发射断层成像/计算机断层扫描动态监测肿瘤生长和代谢活性；治疗后对肿瘤组织进行组织染色和免疫荧光染色，评估肿瘤损伤、增殖抑制和免疫细胞浸润；通过动态血液检测和主要脏器组织学分析评估生物安全性。

结果解读：经动脉给药后48h，CFe-LPE优先蓄积在肿瘤组织，主要脏器中分布量很低，证实其具有良好的肿瘤选择性滞留能力（n=5，文献未明确提供P值）；大鼠原位肝癌治疗后14天，CFe-LPE组平均肿瘤体积为15mm³，显著小于PBS组的1432mm³、阿霉素传统乳液组的188mm³（n=5，P<0.01）；治疗后7天正电子发射断层成像显示，CFe-LPE组肿瘤葡萄糖摄取较基线显著降低，证实肿瘤代谢被显著抑制；组织染色显示CFe-LPE组肿瘤细胞损伤最严重，Ki67增殖阳性率最低，免疫荧光染色显示肿瘤内CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤细胞浸润增加，调节性T细胞比例降低，巨噬细胞向M1型极化，与皮下瘤模型结论一致；在兔VX2肝癌模型中，数字减影血管造影证实CFe-LPE和传统阿霉素乳液都能实现稳定动脉栓塞，治疗后24h无血管再通，随访显示CFe-LPE组肿瘤无明显进展，而阿霉素传统乳液组肿瘤仍持续生长，疗效显著优于传统栓塞；安全性评估显示，CFe-LPE治疗后第7天仅出现白细胞计数和天冬氨酸转氨酶的一过性升高，第14天两项指标均恢复正常，所有动物的主要脏器组织学检查均未观察到明显不可逆损伤，证实CFe-LPE具有良好的生物安全性。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究聚焦于肝细胞癌经动脉栓塞新型功能性材料的开发与疗效验证，未涉及新型生物标志物的筛选与鉴定研究。本研究的核心成果为开发了一种pH响应性CFe-LPE栓塞材料，该材料可响应酸性肿瘤微环境同步释放卡立泊来德和亚铁离子，卡立泊来德通过抑制NHE1同时实现细胞内酸化和细胞外碱化，细胞内酸化显著增强亚铁离子催化的芬顿反应效率，诱导肿瘤细胞发生高效铁死亡，细胞外碱化逆转免疫抑制性肿瘤微环境，最终协同实现“血管栓塞+铁死亡杀伤+抗肿瘤免疫激活”的三重治疗效应。

在大鼠原位肝癌模型中，CFe-LPE经动脉治疗后平均肿瘤体积仅为15mm³，显著低于传统阿霉素TACE治疗的188mm³（n=5，P<0.01），在兔原位肝癌模型中也显示出优于传统TACE的肿瘤生长抑制效果，且在多种动物模型中均验证了良好的生物安全性。本研究的创新点在于首次提出了同时调控细胞内和细胞外肿瘤pH，协同增强铁死亡和抗肿瘤免疫的栓塞材料设计策略，为临床肝细胞癌TACE治疗提供了具有转化潜力的新候选方案。本研究存在一定局限性，目前仅在小动物模型中完成了疗效验证，受小动物血管直径限制无法完全模拟临床超选择性栓塞的条件，后续需要在大动物模型中进一步验证其疗效和安全性，同时可探索联合靶向多个pH调控通路进一步提升治疗效果。