VDLIN：基于深度学习的甲基钴胺素启发式免疫调节化合物筛选平台。
VDLIN: A Deep Learning-Based Platform for Methylcobalamin-Inspired Immunomodulatory Compound Screening.
1. 领域背景与文献
发表期刊：Advanced Science；影响因子：未公开；研究领域：免疫调节药物研发、深度学习在药物筛选中的应用、炎症与抗病毒免疫调控
细胞因子风暴是COVID-19、脓毒症等疾病中导致多器官损伤甚至死亡的关键病理过程，现有抗炎治疗常伴随免疫抑制的副作用，难以平衡炎症抑制与抗病毒免疫的需求。甲基钴胺素（MCB，活性维生素B12）作为甲硫氨酸循环的关键辅因子，已被证实具有抗炎作用，可缓解COVID-19相关的细胞因子风暴，但同时会抑制I型干扰素反应，削弱宿主的抗病毒先天免疫，这一局限性限制了其临床应用。此外，膦-氮-膦（PNP）钳形配体在催化和配位化学领域应用广泛，但在免疫调节、抗病毒等生物医学领域的研究仍处于空白。近年来，深度学习技术在药物筛选中的应用极大加速了候选化合物的发现，但其针对兼具抗炎与增强抗病毒免疫双功能的免疫调节剂的定向筛选模型仍较为缺乏。当前领域的核心研究空白在于缺乏能同时抑制过度炎症反应且不削弱甚至增强抗病毒免疫的新型化合物，以及高效筛选这类化合物的技术平台。本研究正是针对这一空白，开发基于深度学习的VDLIN模型，筛选并验证兼具双功能的免疫调节化合物。
2. 文献综述解析
作者从MCB的免疫调节作用局限性、PNP配体的生物应用潜力、深度学习在药物筛选的技术进展三个维度展开综述，系统梳理了领域内现有研究的成果与不足，为自身研究的创新方向奠定基础。
现有研究已明确MCB通过调控NF-κB通路发挥抗炎作用，可在细胞和动物模型中抑制LPS诱导的炎症因子表达，降低脓毒症小鼠的死亡率，但同时会下调EGR1介导的I型干扰素通路，抑制宿主的抗病毒免疫反应，这一双重调控特性使其在感染性炎症疾病中的应用存在风险。PNP配体因独特的电子和结构特性在催化领域展现出优异的活性和选择性，但目前尚未有研究深入探索其在免疫调节领域的应用潜力，这一方向存在较大的研究空间。深度学习技术已成为药物筛选的重要工具，各类模型如卷积神经网络（CNN）、支持向量机（SVM）等可高效分析复杂的化学和生物数据，加速候选化合物的发现，但针对MCB启发的、同时调控炎症与抗病毒免疫的双功能化合物的定向筛选模型仍未被开发。
与现有研究相比，本研究的创新价值在于首次将MCB的免疫调节特征与深度学习技术结合，构建了VDLIN模型，实现了对兼具抗炎和增强抗病毒免疫双功能化合物的精准筛选，解决了MCB在免疫调节中的局限性，为新型免疫调节剂的研发提供了新的技术范式和候选化合物。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的核心目标是解决MCB抗炎但抑制抗病毒免疫的双重调控难题，开发基于CNN的VDLIN深度学习模型，筛选出同时抑制NF-κB介导的炎症通路和增强EGR1介导的抗病毒先天免疫通路的化合物，并验证其作用机制与治疗潜力。整体技术路线遵循“问题提出→机制探究→模型构建→化合物筛选→功能验证”的闭环逻辑，先明确MCB的免疫调节机制及局限性，再通过深度学习模型筛选目标化合物，最后从细胞、动物层面验证化合物的功能与机制。
3.1 MCB的免疫调节作用验证及机制初探
实验目的：验证MCB的抗炎效果，同时探究其对宿主先天抗病毒免疫的影响，并解析其分子机制。
方法细节：以LPS刺激的小鼠巨噬细胞RAW264.7为细胞模型，设置不同浓度（2-50 μM）和时间（0-24 h）的MCB处理组，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测Il1b、Il6、Ifnb1等关键基因的mRNA表达水平；通过免疫印迹（Western Blot）检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX2）、磷酸化NF-κB p65的蛋白表达；构建LPS诱导的小鼠脓毒症模型（20 mg/kg LPS腹腔注射），观察MCB处理对小鼠存活率的影响；进一步采用转录组测序（RNA-seq）分析MCB处理后的基因表达变化，结合GO、KEGG富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析探究调控通路；通过染色质开放性测序（ATAC-seq）分析染色质可及性变化，转录因子足迹分析识别关键调控转录因子；采用靶向切割及标签测序（CUT&Tag）验证EGR1的结合位点，并通过过表达EGR1的HEK293T细胞模型和敲低EGR1的RAW264.7细胞模型，验证EGR1对干扰素通路的调控作用。
结果解读：MCB以时间和剂量依赖的方式抑制LPS诱导的Il1b、Il6等炎症基因的mRNA表达，在20 μM浓度、处理12小时时抑制效果最显著（n=3，P<0.001）；同时，MCB也显著下调Ifnb1及干扰素刺激基因（ISGs）的表达（n=3，P<0.01）；体内脓毒症模型中，MCB处理组小鼠的存活率显著提高（n=10，P<0.05）。RNA-seq结果显示，MCB处理后，炎症相关基因显著下调，而自噬、代谢相关基因显著上调；GO、KEGG富集分析表明，MCB主要通过抑制NF-κB通路发挥抗炎作用；ATAC-seq结果显示，MCB降低了NF-κB p65结合位点的染色质可及性，免疫印迹结果也证实MCB抑制LPS诱导的NF-κB p65磷酸化。CUT&Tag结果显示，LPS刺激后EGR1的结合位点染色质可及性显著增加，而MCB处理后显著降低；功能实验表明，过表达EGR1可增强Poly(I:C)诱导的Ifnb1等基因表达（n=3，P<0.01），敲低EGR1则抑制LPS诱导的这些基因表达（n=3，P<0.01），证实MCB通过抑制EGR1削弱抗病毒免疫。
产品关联：实验所用关键产品：Wanleibio的兔抗COX2抗体；Proteintech的兔抗iNOS抗体（货号80517-1-RR）、兔抗β-微管蛋白抗体（货号10094-1-AP）、小鼠抗β-肌动蛋白抗体（货号66009-1-Ig）、小鼠抗GAPDH抗体（货号60004-1-Ig）、小鼠抗DYKDDDDK标签抗体（货号66008-4-Ig）；Cell Signaling Technology的兔抗磷酸化NF-κB p65（Ser536）抗体（货号3033）、兔抗EGR1抗体（货号4153）；Proteintech的HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）（货号SA00001-2）、HRP标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（货号SA00001-1）；ABclonal的活性重组小鼠CSF-2/GM-CSF蛋白（货号RP01206）；MedChemExpress的脂多糖（LPS，货号HY-D1056）、甲基钴胺素（MCB，货号HY-B0586）等。
3.2 VDLIN深度学习模型构建与化合物筛选
实验目的：开发能精准筛选同时抑制NF-κB炎症通路和增强EGR1介导的抗病毒免疫通路的化合物的深度学习模型，并筛选候选化合物。
方法细节：整合LINCS、DrugBank、ChEMBL数据库中的化合物结构和对应的基因表达数据，将化合物的SMILES字符串转换为语法树并编码为独热数组，通过变分自编码器（VAE）进行降维处理，生成模型的输入特征向量；选取NF-κB通路的5个关键炎症基因（IL1B、IL6、TNF、PTGS2、NOS2）和EGR1介导的干扰素通路的5个关键基因（EGR1、IFNB1、ISG15、IFIT3、CXCL10）的表达变化作为模型的输出标签；构建基于卷积神经网络（CNN）的VDLIN模型，采用混淆矩阵、受试者工作特征（ROC）曲线评估模型的预测性能，并与支持向量机（SVM）、k近邻（kNN）、逻辑回归、随机森林、梯度提升等传统机器学习模型进行对比；在模型性能验证后，用其筛选CAS化合物数据库，得到候选化合物Co7。
结果解读：VDLIN模型的ROC曲线下面积（AUC）为0.931，真阳性率（TPR）为92.31%，显著优于所有对比的传统机器学习模型；在加入10%、20%、30%的合成标签噪声时，VDLIN模型的F1值仅下降4.3%，远低于梯度提升模型的9.8%和SVM的11.2%，显示出更强的鲁棒性；筛选得到的化合物Co7在RAW264.7、J774巨噬细胞及原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）、腹腔巨噬细胞（PMs）中均能显著诱导Ifnb1的表达，且在处理3小时时表达达到峰值（n=3，P<0.001）。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用TensorFlow、Keras等深度学习框架，RDKit等化学信息学工具，以及CAS化合物数据库等资源。
3.3 Co7的免疫调节功能及机制验证
实验目的：验证Co7同时抑制炎症和增强抗病毒免疫的双功能，并解析其作用的分子通路。
方法细节：用Co7处理RAW264.7、J774等巨噬细胞，采用实时荧光定量PCR检测Ifnb1、Il1b等基因的表达；通过转录组测序分析Co7处理后的基因表达变化；采用TLR4抑制剂原花青素B1、TRIF抑制剂Pepinh-TRIF TFA、TBK1/IKKε抑制剂GSK8612处理细胞，观察Ifnb1表达的变化；利用Tlr4或Trif基因敲除小鼠的原代BMDMs和腹腔巨噬细胞，验证Co7作用的上游通路；构建LPS诱导的小鼠脓毒症模型，观察Co7处理对小鼠存活率的影响；通过水泡性口炎病毒（VSV）感染实验，验证Co7的抗病毒效果。
结果解读：Co7处理后，巨噬细胞中Ifnb1及干扰素刺激基因的表达显著上调（n=3，P<0.001），同时能显著抑制LPS、VSV、脑心肌炎病毒（EMCV）、单纯疱疹病毒（HSV）诱导的炎症因子表达（n=3，P<0.01）；转录组测序结果显示，Co7上调EGR1、Ifnb1、Ifna4等基因的表达，下调Il1b、Il6等炎症基因的表达；抑制剂实验和基因敲除实验证实，Co7通过TLR4-TRIF-TBK1通路激活I型干扰素反应；体内脓毒症模型中，Co7处理组小鼠的存活率显著提高（n=10，P<0.01）；VSV感染实验显示，Co7预处理能显著抑制病毒在RAW264.7和HT29细胞中的复制（n=3，P<0.001）。
产品关联：实验所用关键产品：Selleck的TLR2抑制剂C29（货号S6597）；MedChemExpress的TLR4抑制剂原花青素B1（货号HY-N0795）、MyD88抑制剂MyD88-IN-1（货号HY-149992）、TRIF抑制剂Pepinh-TRIF TFA（货号HY-P2565）；TargetMol的TBK1/IKKε抑制剂GSK8612（货号T5540）等。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本研究以NF-κB通路的炎症基因和EGR1介导的干扰素通路基因作为核心Biomarker，通过深度学习模型定向筛选能同时调控两类Biomarker的化合物，成功得到兼具抗炎和增强抗病毒免疫双功能的Co7，为免疫调节疾病的治疗提供了新的候选化合物和Biomarker体系。
Biomarker定位：本研究涉及的Biomarker分为两类，一类是NF-κB通路相关的炎症Biomarker，包括Il1b、Il6、Tnf、Ptgs2、Nos2；另一类是EGR1介导的抗病毒免疫Biomarker，包括Egr1、Ifnb1、Isg15、Ifit3、Cxcl10。筛选逻辑为：首先通过MCB处理的转录组分析，明确这10个基因是调控炎症与抗病毒免疫的关键节点；然后将这10个基因的表达变化作为VDLIN模型的输出标签，筛选能同时下调炎症Biomarker、上调抗病毒免疫Biomarker的化合物。
研究过程详述：这些Biomarker来源于LPS刺激的小鼠巨噬细胞转录组数据，通过实时荧光定量PCR、转录组测序验证了其在MCB处理后的表达变化；对于候选化合物Co7，通过细胞实验验证其对这些Biomarker的调控作用，其中Ifnb1的表达在Co7处理3小时后达到峰值，为对照组的6.2倍（n=3，P<0.001），Il1b的表达在LPS+Co7处理组较LPS组降低了75.3%（n=3，P<0.01）；在LPS诱导的小鼠脓毒症模型中，Co7处理组的炎症Biomarker表达水平显著降低，抗病毒免疫Biomarker表达水平显著升高（文献未明确提供该数据，基于图表趋势推测）。
核心成果提炼：Co7作为新型免疫调节化合物，能同时抑制NF-κB介导的炎症反应和增强TLR4-TRIF-TBK1介导的I型干扰素反应，其创新性在于解决了MCB抗炎但抑制抗病毒免疫的局限性，首次通过深度学习模型筛选出基于MCB启发的双功能免疫调节剂；该化合物在细胞和动物模型中均展现出良好的抗炎和抗病毒效果，为COVID-19、脓毒症等炎症伴免疫抑制的疾病提供了新的治疗候选；同时，本研究确立的10个Biomarker为后续筛选同类免疫调节剂提供了标准化的评估体系。