源自癌症相关成纤维细胞的乳酸可促进前列腺癌的选择性剪接和去势抵抗。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Lactate derived from cancer-associated fibroblasts promotes alternative splicing and castration resistance in prostate cancer；

发表期刊：Science Advances；影响因子：12.8（2023年）；研究领域：肿瘤学，前列腺癌耐药机制。

领域共识：前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，雄激素剥夺疗法是晚期前列腺癌的标准一线治疗方案，但绝大多数患者在治疗后1~3年内会进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），解析去势抵抗的分子机制、开发新的治疗策略是当前领域的研究热点。传统的Warburg效应模型认为肿瘤细胞是肿瘤微环境中乳酸的主要生产者，而近年提出的"反向Warburg效应"指出，间质细胞尤其是癌相关成纤维细胞（CAFs）也可以产生大量乳酸供给肿瘤细胞，调控肿瘤细胞功能。已有研究观察到前列腺癌进展为CRPC的过程中，间质细胞葡萄糖代谢显著升高，提示这种代谢重编程与去势抵抗相关，但其具体调控机制尚未明确。

选择性剪接是增加蛋白质组多样性的重要过程，雄激素受体（AR）的选择性剪接产生的AR变体7（AR-V7），是前列腺癌发生去势抵抗的关键驱动因素，已有研究证实多种剪接体组分和剪接因子参与AR-V7的调控，但肿瘤微环境中的代谢因素如何调控AR剪接这一问题，目前仍缺乏深入研究。本研究针对这一研究空白，解析了CAFs亚群来源乳酸调控AR可变剪接、促进恩扎卢胺耐药的分子机制，为克服前列腺癌去势抵抗提供了新的治疗靶点和策略。

2. 文献综述解析

作者从两个维度梳理了领域内现有研究，分别是肿瘤微环境乳酸代谢研究和AR可变剪接与去势抵抗研究。现有研究已经明确Warburg效应和反向Warburg效应在多种实体瘤中的存在，证实CAFs作为肿瘤微环境中最主要的间质细胞，可以分泌乳酸进入微环境，被肿瘤细胞摄取后调控肿瘤细胞功能；同时已有临床观察证实CRPC组织中基质细胞糖代谢水平显著高于激素敏感性前列腺癌，提示乳酸代谢与去势抵抗存在关联，但不同细胞来源乳酸在前列腺癌进展中的具体功能，以及乳酸除作为能量底物之外的非代谢功能，尚未被阐明。

在AR可变剪接研究方向，现有研究已经明确AR-V7的产生是前列腺癌对雄激素剥夺疗法产生耐药的核心机制，也已经鉴定出多种剪接体组分和剪接因子参与AR-V7生成的调控，但是代谢物尤其是肿瘤微环境中基质细胞来源的乳酸，如何通过翻译后修饰调控剪接体功能进而影响AR可变剪接，这一关键机制始终缺乏研究。

本研究的创新价值在于，首次通过单细胞测序在恩扎卢胺耐药的前列腺癌组织中鉴定出比例显著升高的APCDD1阳性CAFs亚群，明确该亚群可以通过IGF1R/PI3K/AKT/HIF-1α/LDHA通路激活，分泌大量乳酸进入肿瘤微环境；首次揭示了乳酸进入前列腺癌细胞后，诱导剪接体核心组分SNRPA发生K123位点乳酸化，增强SNRPA与pre-mRNA和染色质的结合能力，促进AR剪接产生AR-V7，最终介导恩扎卢胺耐药。这一研究填补了肿瘤微环境代谢调控肿瘤细胞可变剪接的研究空白，为临床克服恩扎卢胺耐药提供了新的可靶向治疗位点。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的核心科学问题是CAFs来源乳酸是否以及如何调控前列腺癌去势抵抗，研究目标是明确APCDD1阳性CAFs在恩扎卢胺耐药中的作用及具体分子机制，验证靶向乳酸代谢通路是否可以逆转恩扎卢胺耐药。整体技术路线遵循"临床样本组学鉴定→细胞动物功能验证→分子机制解析→治疗靶点验证"的逻辑闭环，具体实验环节解析如下：

3.1 单细胞测序鉴定恩扎卢胺耐药相关CAFs亚群

实验目的：探究恩扎卢胺耐药后前列腺癌肿瘤微环境的细胞异质性变化，筛选出与耐药相关的CAFs亚群。方法细节：收集4例配对的恩扎卢胺初治和恩扎卢胺耐药前列腺癌患者组织，共8个样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析主要细胞类型的比例变化，对成纤维细胞进行进一步亚分群，结合免疫荧光染色在临床样本中验证特异性标志物的表达，最后通过Kaplan-Meier生存分析分析该亚群丰度与患者预后的关系。结果解读：降维可视化分析显示，恩扎卢胺耐药后成纤维细胞群体丰度显著升高，对成纤维细胞进行亚分群后得到10个亚群，其中c4亚群比例在耐药后显著增加，热图分析显示APCDD1在该亚群特异性高表达。免疫荧光染色结果显示，去势抵抗性前列腺癌组织中APCDD1阳性细胞比例为38.7±5.2%，显著高于激素敏感性前列腺癌组织的11.2±3.1%（n=7每组，P<0.0001）。Kaplan-Meier生存分析显示，APCDD1阳性CAFs丰度越高，患者预后越差，在SYSUCC-PC队列中，无进展生存期风险比HR=2.34（95%CI 1.21-4.53，P=0.011），总生存期HR=2.61（95%CI 1.13-6.03，P=0.025），在prad_su2c_2019外部验证队列中也得到了一致结果，证实APCDD1阳性CAFs与恩扎卢胺耐药相关。本实验结果对应图1：

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用10x Genomics单细胞测序试剂盒、流式细胞分选仪、激光共聚焦显微镜。

3.2 功能验证APCDD1阳性CAFs诱导恩扎卢胺耐药

实验目的：通过细胞、类器官、动物实验验证APCDD1阳性CAFs是否能够诱导前列腺癌细胞发生恩扎卢胺耐药。方法细节：采用流式细胞术从前列腺癌组织中分离APCDD1阳性CAFs（A+CAFs）和APCDD1阴性CAFs（A−CAFs），通过Boyden小室建立间接共培养体系，结合克隆形成实验、患者来源类器官（PDO）实验、去势NSG小鼠皮下成瘤实验验证A+CAFs的功能；收集A+CAFs和A−CAFs的条件培养基处理前列腺癌细胞，进行转录组测序分析富集通路，最后用AR-V7特异性PROTAC降解AR-V7，验证AR-V7在A+CAFs诱导耐药中的作用。结果解读：免疫荧光染色证实分离得到的A+CAFs高表达APCDD1和CAFs标志物COL1A1，克隆形成实验显示，在恩扎卢胺处理条件下，共培养A+CAFs的前列腺癌细胞克隆数显著高于共培养A−CAFs组（n=3，P<0.001）；PDO实验显示，A+CAFs共培养的类器官体积显著大于A−CAFs共培养组（n=30，P<0.01）；体内实验显示，A+CAFs与前列腺癌细胞共注射到去势NSG小鼠，恩扎卢胺处理后肿瘤体积显著大于A−CAFs共注射组（n=5每组，P<0.001）。条件培养基处理实验显示，只有A+CAFs条件培养基（A+CTM）能够提高前列腺癌细胞活力，诱导恩扎卢胺耐药，转录组富集分析显示A+CTM处理后RNA剪接相关通路显著富集，反转录PCR和蛋白质印迹实验证实A+CTM处理后AR-V7表达水平显著升高；使用AR-V7 PROTAC降解AR-V7后，A+CTM诱导的恩扎卢胺耐药被完全逆转（n=3，P<0.001），证实A+CAFs通过促进AR-V7表达诱导恩扎卢胺耐药。本实验结果对应图2：

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用流式细胞仪、Boyden小室、PROTAC降解剂、细胞培养试剂。

3.3 代谢组学筛选乳酸为关键效应分子

实验目的：明确A+CTM中哪类分子介导了AR-V7表达和恩扎卢胺耐药。方法细节：依次对A+CTM进行热灭活、蛋白酶K、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶处理，排除蛋白质、DNA、RNA等大分子的作用；随后对A+CTM和A−CTM进行非靶向和靶向代谢组学分析，筛选差异富集的代谢物；通过体外乳酸处理、体内动物实验、PDO实验验证乳酸的功能；最后通过增加共培养体系换液频率降低乳酸浓度，反向验证乳酸的作用。结果解读：经过上述处理后，A+CTM仍然能够诱导AR-V7表达和恩扎卢胺耐药，排除了大分子物质的作用；代谢组学分析显示糖酵解相关代谢物在A+CTM中显著富集，其中乳酸是上调最显著的代谢物，乳酸分泌定量检测显示A+CAFs分泌的乳酸水平显著高于A−CAFs、C4-2癌细胞和对照组（P<0.001）。体外实验显示乳酸处理能够增加恩扎卢胺处理下的癌细胞克隆形成数目，上调AR-V7表达（n=3，P<0.01）；体内实验显示乳酸处理后，去势NSG小鼠皮下肿瘤体积更大，恩扎卢胺耐药性更强（n=5每组，P<0.001）；PDO实验也得到了一致结果（n=30，P<0.001）；在A+CAFs和癌细胞共培养体系中，增加换液频率降低体系中乳酸浓度后，癌细胞对恩扎卢胺的敏感性恢复（n=3，P<0.001），证实A+CAFs来源乳酸是介导恩扎卢胺耐药的关键效应分子。本实验结果对应图3：

实验所用关键产品：实验所用关键产品：Abbkine的CheKine Micro Lactate Assay Kit（货号KTB1100），其余领域常规使用液相色谱-质谱联用仪。

3.4 分子机制解析乳酸通过SNRPA K123乳酸化调控AR剪接

实验目的：明确乳酸诱导AR-V7表达的具体分子机制。方法细节：首先通过Seahorse能量代谢检测验证乳酸对癌细胞氧化磷酸化的影响，使用氧化磷酸化抑制剂鱼藤酮处理验证氧化磷酸化是否参与乳酸诱导的耐药；随后通过蛋白质印迹检测不同翻译后修饰的水平，开展乳酸化蛋白质组学筛选差异乳酸化蛋白，结合小干扰RNA敲降筛选关键靶蛋白；接着通过质谱鉴定SNRPA的乳酸化位点，通过点突变、转录组分析、RNA结合实验、染色质免疫共沉淀验证乳酸化位点的功能；最后筛选催化SNRPA乳酸化的乳酸转移酶。结果解读：Seahorse检测显示乳酸和A+CTM都能够增加ATP产生和基础氧消耗速率，增强癌细胞氧化磷酸化（n=5，P<0.01），但使用鱼藤酮抑制氧化磷酸化后，不能逆转A+CTM诱导的恩扎卢胺耐药和AR-V7表达升高，说明乳酸诱导耐药不依赖其能量底物功能。蛋白质印迹显示A+CTM处理后，癌细胞整体蛋白质乳酸化水平显著升高，而泛素化、磷酸化、乙酰化水平没有明显变化；乳酸化蛋白质组学显示剪接体核心组分SNRPA是差异最显著的乳酸化蛋白，敲降SNRPA后能够逆转A+CTM诱导的恩扎卢胺耐药和AR-V7表达升高（n=3，P<0.001）。质谱鉴定得到SNRPA的三个潜在乳酸化位点K96、K98、K123，点突变实验证实只有K123R突变能够显著降低SNRPA的乳酸化水平；在敲降了内源性SNRPA的癌细胞中稳定表达SNRPA K123R突变体后，乳酸处理无法诱导AR-V7表达和恩扎卢胺耐药（n=3，P<0.001）；机制实验显示，乳酸处理能够增强SNRPA与AR基因pre-mRNA的结合以及与染色质的结合，促进AR剪接产生AR-V7。免疫共沉淀证实SNRPA与氨酰tRNA合成酶AARS1直接结合，敲降AARS1能够消除乳酸诱导的SNRPA K123乳酸化，降低AR-V7表达和恩扎卢胺耐药（n=3，P<0.001），证实AARS1是催化SNRPA K123乳酸化的乳酸转移酶。本实验结果对应图4、图5：

实验所用关键产品：PTM BioLab定制的SNRPA K123乳酸化位点特异性抗体，领域常规使用Seahorse能量代谢分析仪、蛋白质质谱、染色质免疫共沉淀试剂盒。

3.5 上游通路解析恩扎卢胺激活A+CAFs IGF1R/PI3K/AKT/HIF-1α轴促进乳酸产生

实验目的：明确恩扎卢胺如何促进A+CAFs代谢重编程产生乳酸。方法细节：对恩扎卢胺持续处理后的A+CAFs和A−CAFs进行转录组测序，结合单细胞测序数据分析差异富集通路；使用PI3K/AKT通路抑制剂处理A+CAFs，检测乳酸产生水平以及条件培养基对癌细胞耐药性的影响，体内体外验证功能；分别抑制EGFR、FGFR、IGF1R三种受体酪氨酸激酶，明确上游激活受体。结果解读：转录组分析显示，A+CAFs中PI3K/AKT、HIF-1α、糖酵解通路显著上调，差异基因分析显示乳酸脱氢酶A（LDHA）和HIF-1α表达显著上调；使用PI3K-AKT-IN-1抑制PI3K/AKT通路后，HIF-1α和LDHA蛋白表达下调，A+CAFs乳酸分泌显著降低（n=3，P<0.01），其条件培养基无法诱导癌细胞AR-V7表达和恩扎卢胺耐药（n=3，P<0.001）；体内实验证实，PI3K-AKT-IN-1处理后，A+CAFs共诱导的肿瘤生长显著受抑制，恩扎卢胺敏感性恢复（n=5，P<0.001）。分别抑制三种受体酪氨酸激酶后，只有IGF1R抑制剂OSI906处理能够有效抑制PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α/LDHA通路激活，降低A+CAFs乳酸分泌（n=3，P<0.01），证实恩扎卢胺通过激活A+CAFs的IGF1R/PI3K/AKT/HIF-1α轴，上调LDHA表达，促进乳酸产生和分泌。本实验结果对应图6：

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用通路抑制剂、转录组测序试剂。

3.6 治疗靶点验证靶向乳酸转运可逆转恩扎卢胺耐药

实验目的：验证靶向乳酸转运是否可以作为克服恩扎卢胺耐药的临床治疗策略。方法细节：对激素敏感性前列腺癌和CRPC临床样本进行免疫荧光染色，检测单羧酸转运体MCT1（癌细胞表达）和MCT4（CAFs表达）的表达水平，结合Kaplan-Meier生存分析验证其与患者预后的相关性；使用MCT1/MCT4双抑制剂7ACC1处理，体外体内验证其逆转耐药的功能；敲降A+CAFs的LDHA，验证抑制乳酸生成的治疗效果。结果解读：免疫荧光染色显示，CRPC组织中癌细胞MCT1表达和CAFs MCT4表达显著高于激素敏感性前列腺癌组织（n=7每组，P<0.001）；生存分析显示，MCT1和MCT4高表达的前列腺癌患者预后更差，在SYSUCC-PC队列（n=70）中，无进展生存期HR=2.31（95%CI 1.32-4.05，P=0.003），总生存期HR=2.57（95%CI 1.36-4.86，P=0.004），外部验证队列也得到了一致结果。体外实验显示，7ACC1处理能够显著抑制A+CTM诱导的癌细胞增殖，逆转恩扎卢胺耐药（n=3，P<0.001）；体内异种移植模型显示，7ACC1联合恩扎卢胺处理后，肿瘤生长显著慢于对照组（n=5，P<0.001）；敲降A+CAFs的LDHA后，其条件培养基无法促进癌细胞恩扎卢胺耐药，体内共注射肿瘤生长也显著受抑制（n=5，P<0.001），证实靶向乳酸生成和转运能够有效逆转恩扎卢胺耐药，是极具潜力的治疗策略。本实验结果对应图7：

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用MCT抑制剂、慢病毒敲降载体。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究涉及的潜在生物标志物包括APCDD1阳性CAFs、MCT1/MCT4、SNRPA K123乳酸化三类。筛选验证逻辑为：首先通过单细胞RNA测序对恩扎卢胺耐药前后前列腺癌组织的成纤维细胞进行亚分群，筛选得到耐药后比例显著升高、特异性高表达APCDD1的CAFs亚群，随后通过免疫荧光染色在大样本临床组织中验证，结合两个独立临床队列的生存分析明确其预后价值；接着通过代谢组学、乳酸化蛋白质组学筛选得到乳酸修饰的SNRPA，明确其与AR-V7表达和耐药的相关性；最后明确乳酸转运相关的MCT1和MCT4在CRPC组织中的表达特征及其预后价值。

APCDD1阳性CAFs来源于前列腺癌肿瘤微环境间质，通过免疫荧光染色即可检测其比例，在CRPC组织中APCDD1阳性细胞比例为38.7±5.2%（n=7），显著高于激素敏感性前列腺癌组织的11.2±3.1%（n=7，P<0.0001）。MCT1在癌细胞表达、MCT4在CAFs表达，免疫荧光染色显示CRPC组织中MCT1高表达比例为62.3%，MCT4高表达比例为58.7%，显著高于激素敏感性前列腺癌组织的21.4%和19.6%（P<0.01）。生存分析显示，APCDD1阳性CAFs高丰度患者对比低丰度患者，SYSUCC-PC队列中位无进展生存期为12个月 vs 24个月（HR=2.34，P=0.011），中位总生存期为28个月 vs 45个月（HR=2.61，P=0.025）；MCT1/MCT4高表达患者对比低表达患者，SYSUCC-PC队列中位无进展生存期为14个月 vs 27个月（HR=2.31，P=0.003），中位总生存期为30个月 vs 48个月（HR=2.57，P=0.004），上述结果在外部验证队列中均得到一致验证。SNRPA K123乳酸化水平在恩扎卢胺耐药组织中显著高于敏感组织，文献未提供具体统计数据。

本研究核心成果是首次明确了APCDD1阳性CAFs丰度、MCT1/MCT4表达水平可作为前列腺癌患者恩扎卢胺治疗预后的预测生物标志物，高表达提示患者更容易发生恩扎卢胺耐药，预后更差。本研究还首次揭示了肿瘤微环境中CAFs来源乳酸促进前列腺癌去势抵抗的新机制：乳酸被前列腺癌细胞摄取后，通过AARS1催化SNRPA发生K123位点乳酸化，增强SNRPA结合pre-mRNA和染色质的能力，促进AR剪接产生AR-V7，最终介导恩扎卢胺耐药。这一发现填补了代谢物调控可变剪接的研究空白，也为临床克服前列腺癌恩扎卢胺耐药提供了MCT、LDHA、AARS1等多个潜在治疗靶点，体内外实验均证实靶向乳酸转运能够有效逆转恩扎卢胺耐药，具有较高的临床转化价值。