WDR5 重塑 NANOG 凝聚体，以驱动转录程序并维持干细胞特性。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：WDR5 remodels NANOG condensates to drive transcriptional programs and sustain stem cell identity；

发表期刊：Nature Communications；影响因子：17.6；研究领域：干细胞生物学、表观遗传学

干细胞多能性的维持是发育生物学与再生医学领域的核心科学问题，核心转录因子NANOG、OCT4、SOX2通过构建精密的转录调控网络，维持胚胎干细胞（ESC）的未分化状态与自我更新能力。近年来，液-液相分离（LLPS）介导的生物分子凝聚体成为转录调控的前沿研究方向，已有研究证实NANOG可通过其N端无序结构域（NTD）形成相分离凝聚体，招募共激活因子如MED1、BRD4等在超级增强子区域驱动高效转录。然而，当前研究多聚焦于转录因子自身的相分离特性，染色质调控因子如何主动调控转录因子的相分离行为，进而影响干细胞命运决定的机制仍不明确。

表观调控枢纽蛋白WDR5作为SET1/MLL组蛋白甲基转移酶复合物与MOF乙酰转移酶复合物的核心组分，负责介导H3K4三甲基化（H3K4me3）与H4K16乙酰化（H4K16ac）等活性组蛋白标记的建立，同时可与OCT4、MYC等多种转录因子相互作用维持干细胞特性。但已报道的WDR5与转录因子的相互作用多依赖经典的WIN/WBM短肽基序，针对非经典相互作用模式及其功能的研究仍处于空白。本研究聚焦WDR5与NANOG的相互作用，首次揭示了WDR5通过非经典界面结合NANOG同源结构域，主动重塑NANOG凝聚体状态的分子机制，为干细胞多能性维持的转录-表观调控网络提供了新的视角。

2. 文献综述解析

本研究的综述部分围绕“干细胞多能性的转录调控”“NANOG的相分离功能”“WDR5的表观调控枢纽作用”三个核心维度展开，系统梳理了领域内的研究进展与未解决问题。

现有研究已明确NANOG作为干细胞多能性的核心调控因子，可通过同源结构域结合DNA，同时通过NTD形成相分离凝聚体富集共激活因子，驱动多能性基因的高效转录；WDR5则通过招募组蛋白修饰复合物，在基因组范围内建立活性染色质环境，与OCT4、MYC等转录因子协同维持干细胞特性。但这些研究存在两方面局限性：一是对NANOG相分离的调控机制研究不足，仅关注其自身结构域的作用，未涉及染色质调控因子的主动调控；二是对WDR5与转录因子的相互作用研究多局限于经典短肽基序，缺乏对非经典相互作用模式的解析，且未关联到转录因子的相分离行为调控。

本研究的创新价值在于突破了上述局限，首次发现WDR5通过非经典相互作用结合NANOG的同源结构域，将NANOG从无规则聚集状态重塑为动态液滴状相分离凝聚体，直接将表观调控因子的功能与转录因子的相分离行为关联，为干细胞多能性维持的调控机制提供了新的范式，同时为白血病干细胞的靶向治疗提供了潜在靶点。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的核心目标是揭示WDR5对NANOG相分离的调控机制及其在干细胞多能性维持中的功能，核心科学问题是“WDR5如何通过非经典相互作用调控NANOG的凝聚体状态，进而影响转录程序与干细胞特性”，技术路线遵循“相互作用验证→分子机制解析→干细胞功能验证→疾病模型拓展”的闭环逻辑。

3.1 WDR5与NANOG的相互作用及凝聚体重塑

实验目的是验证WDR5与NANOG的直接相互作用，并探究WDR5对NANOG凝聚体状态的调控作用。方法细节上，研究人员首先在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀（co-IP）实验验证内源性与外源性WDR5与NANOG的相互作用，随后利用体外纯化蛋白通过尺寸排阻色谱（SEC）观察NANOG的聚集特性，并通过负染电镜（EM）观察加入WDR5前后NANOG的形态变化；在小鼠胚胎干细胞（mESC）中构建WDR5 C端Flag敲入细胞系，通过免疫荧光染色观察NANOG与WDR5的共定位，并用1,6-己二醇处理验证凝聚体的相分离特性；通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析两者在基因组上的结合位点变化；利用荧光恢复后漂白（FRAP）实验分析凝聚体的动态特性；最后通过体外相分离实验验证WDR5对NANOG凝聚体的浓度依赖型调控。

结果解读显示，co-IP与体外结合实验证实WDR5与NANOG存在直接相互作用；单独NANOG蛋白在SEC中呈现高聚集体峰，电镜下显示无规则 amorphous 聚集，而加入WDR5后，NANOG转变为具有典型相分离特征的液滴状结构；mESC中NANOG与WDR5共定位于核内点状凝聚体，1,6-己二醇处理后凝聚体迅速溶解，ChIP-seq显示两者在多能性基因（如Npm1、Nanog）位点的结合信号显著降低；FRAP实验显示，WDR5与NANOG共表达时形成的凝聚体在漂白后可部分恢复荧光，具有动态液滴特性，而单独NANOG的凝聚体无荧光恢复，呈现固体样特性；体外相分离实验显示，WDR5可浓度依赖地将NANOG从无规则聚集转变为液滴状凝聚体，且NANOG的C端结构域对其聚集特性至关重要。

实验所用关键产品：CRISPR-Cas9系统构建基因敲入细胞系，免疫共沉淀用anti-Flag抗体（ABclonal, AE024）、anti-HA抗体（Cell Signaling, 3724s），负染电镜、FRAP实验用激光共聚焦显微镜，ChIP-seq测序平台。

3.2 WDR5与NANOG相互作用的分子机制

实验目的是解析WDR5与NANOG相互作用的结构基础与分子机制。方法细节上，研究人员通过NANOG截短体的co-IP实验定位结合区域为N端1-155氨基酸（包含同源结构域HD），随后利用等温滴定量热法（ITC）测定WDR5与NANOG HD的结合亲和力，Kd值为5.13±0.03 μM；通过X射线晶体学解析WDR5与NANOG HD（R100A突变体）的复合物结构，分辨率达2.5 Å；利用核磁共振（NMR）技术验证溶液中两者的相互作用界面；最后通过定点突变关键残基，结合ITC、co-IP实验验证相互作用的关键位点。

结果解读显示，NANOG的同源结构域（96-155氨基酸）是与WDR5结合的核心区域，不同于WDR5与其他蛋白的经典WIN/WBM基序相互作用，该相互作用涉及NANOG HD的N端臂（96-104氨基酸）和C端区域（包含R153）；晶体结构显示，NANOG的K96、K98与WDR5的D213、D192形成静电相互作用与氢键，Q97通过水分子介导与WDR5的N214形成氢键；C端的R153插入WDR5的中央通道，与WDR5的S91、F133、C261形成氢键，与F133、F263形成阳离子-π相互作用；NMR实验验证了溶液中两者的相互作用界面与晶体结构一致；定点突变实验显示，NANOG R153A、WDR5 F133A等突变显著降低两者的结合亲和力，且NANOG R153A突变体无法被WDR5重塑为液滴状凝聚体。

实验所用关键产品：ITC系统（MicroCal ITC200），X射线晶体学数据采集于上海同步辐射光源BL19U1，NMR光谱仪（Agilent DD2 600/800 MHz），定点突变试剂盒。

3.3 WDR5-NANOG相互作用对mESC多能性的调控

实验目的是验证WDR5-NANOG相互作用在mESC多能性维持中的功能。方法细节上，研究人员通过CRISPR-Cas9技术构建NANOG R153A敲入mESC细胞系，在血清/LIF培养基中培养，观察细胞形态变化；通过碱性磷酸酶（AP）染色检测干细胞多能性标记；利用RNA-seq分析转录组变化；通过ChIP-seq分析NANOG、WDR5的染色质结合及H3K4me3、H4K16ac的组蛋白修饰水平；通过时间分辨ChIP-qPCR和新生RNA捕获实验分析转录调控的动态过程。

结果解读显示，NANOG R153A mESC在血清/LIF培养基中从紧凑的克隆形态转变为扁平化的分化形态，AP染色阳性率显著降低（n=3，P<0.01），自我更新能力受损；RNA-seq分析显示，多能性核心基因如Klf4、Esrrb、Sox2显著下调，分化相关基因如Runx2、Hoxa7显著上调；ChIP-seq显示，NANOG与WDR5在共定位位点的结合信号显著降低，从7796个共结合峰降至143个，且H3K4me3与H4K16ac在这些位点的修饰水平显著降低；时间分辨实验显示，组蛋白修饰水平的降低先于mRNA水平的下降，表明表观调控是转录变化的上游原因。

实验所用关键产品：CRISPR-Cas9系统构建敲入细胞系，RNA-seq、ChIP-seq测序平台，碱性磷酸酶染色试剂盒，新生RNA捕获试剂盒（STAR-Click）。

3.4 WDR5-NANOG轴在白血病干细胞中的治疗潜力

实验目的是探究WDR5-NANOG相互作用在白血病干细胞（LSC）中的功能及靶向治疗潜力。方法细节上，研究人员首先分析AML1-ETO9a（AE9a）驱动的急性髓系白血病（AML）模型中NANOG与WDR5的表达水平；用WDR5抑制剂C16处理AE9a c-Kit+细胞，通过集落形成实验检测自我更新能力，通过流式细胞术分析LSC比例与分化状态；利用RNA-seq分析转录组变化；最后通过小鼠骨髓移植实验验证C16的体内治疗效果。

结果解读显示，AE9a造血干祖细胞（HSPC）中NANOG表达显著上调，而WDR5表达无显著变化；C16处理显著降低AE9a细胞的集落形成能力（n=3，P<0.0001），LSC比例从6%降至几乎为0（n=3，P<0.001），并促进白血病细胞向成熟髓系细胞分化；RNA-seq显示，C16处理后干细胞相关基因如Notch信号通路基因显著下调，分化相关基因显著上调；体内实验显示，C16处理使小鼠体内LSC数量减少约50%（n=7，P<0.01），显著抑制白血病进展，且对正常HSPC的毒性远低于Menin抑制剂Revumenib。

实验所用关键产品：WDR5抑制剂C16（MedChemExpress, HY-133121），Menin抑制剂Revumenib（MedChemExpress, HY-136175），流式细胞仪（BD FACSAria III），小鼠白血病模型。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究未鉴定传统意义上的诊断或预后生物标志物，但揭示了WDR5-NANOG相互作用作为干细胞特性维持的功能模块，可作为白血病干细胞靶向治疗的潜在功能靶点。

该功能模块的验证逻辑遵循“细胞系相互作用验证→干细胞功能验证→白血病模型体内外验证”的完整链条：首先在HEK293T与mESC中验证WDR5与NANOG的相互作用及对凝聚体的调控，随后在mESC中验证该相互作用对多能性维持的功能，最后在AE9a白血病模型中验证靶向该相互作用的治疗潜力。研究过程中，在AE9a白血病模型中，NANOG的高表达与LSC的自我更新能力直接相关，靶向WDR5-NANOG相互作用的C16可特异性抑制LSC的自我更新并促进分化；特异性方面，C16对正常HSPC的细胞活力影响仅为10%左右，远低于Revumenib的75%；敏感性方面，C16处理后AE9a LSC比例从6%降至几乎为0（n=3，P<0.001），集落形成能力降低60%（n=3，P<0.0001）。

核心成果在于首次将WDR5对NANOG相分离的调控与白血病干细胞的维持关联，为白血病的靶向治疗提供了新的潜在靶点，同时为干细胞多能性维持的转录-表观调控网络提供了新的机制。该功能靶点的创新性在于突破了传统靶向转录因子或表观酶的思路，直接靶向转录因子与表观调控因子的相互作用界面，具有更高的特异性与更低的脱靶风险。