建立人类患者来源的类器官生物库，以模拟口腔鳞状细胞癌的肿瘤异质性和治疗敏感性。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：A human patient-derived organoid biobank to model tumor heterogeneity and therapeutic vulnerability for oral squamous cell carcinoma；
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：口腔鳞状细胞癌，患者来源类器官，化疗耐药。

领域共识：口腔鳞状细胞癌（OSCC）占头颈部鳞状细胞癌的多数，尽管手术、放化疗技术取得进展，但局部复发、颈部淋巴结转移和治疗耐药仍然是未解决的临床难题，导致患者治疗效果差、死亡率高。肿瘤异质性是导致传统预后标志物价值有限、不同患者治疗效果差异大的核心原因，因此迫切需要开发能准确反映OSCC生物学特征的临床前模型，用于患者分层、治疗指导和治疗靶点筛选。传统的细胞系和细胞来源异种移植模型无法保留人类肿瘤的复杂性和异质性，患者来源异种移植（PDX）模型则存在成本高、周期长、通量低的局限性。近年来，患者来源类器官（PDO）作为新兴的三维培养模型，能保留亲本肿瘤的遗传和表型特征，相比PDX在成本、时间、可扩展性和高通量药物筛选方面更具优势，已经在结直肠癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症研究中得到应用，但OSCC领域之前的PDO培养体系成功率较低，缺乏足够规模的生物库用于系统研究治疗耐药。顺铂是OSCC一线化疗药物，但多数患者最终会发生耐药，因此需要明确顺铂耐药的分子机制，找到可靶向的调控位点来逆转耐药。

现有OSCC PDO培养体系的成功率最高仅为60%，无法满足大规模生物库构建的需求，同时也缺乏利用OSCC PDO系统筛选顺铂耐药关键靶点的研究。本研究针对这一研究空白，优化了OSCC PDO培养体系，成功构建包含46株OSCC PDO的生物库，验证了其保留亲本肿瘤组织学、分子特征的可靠性，并进一步利用该生物库筛选得到顺铂耐药的关键调控靶点，为OSCC的精准治疗提供了新的方向。

2. 文献综述解析

作者梳理现有研究发现，OSCC存在明显的肿瘤内和肿瘤间异质性，现有TNM分期等常规预后标志物对患者分层的价值有限，传统临床前模型无法很好地保留这种异质性，限制了基础研究向临床转化的效率。既往研究已经证实PDO能保留亲本肿瘤的遗传学和表型特征，是很有前景的转化研究工具，2019年已有研究首次成功建立OSCC类器官，并验证了其模拟患者放化疗响应的潜力，但既往研究建立OSCC PDO的成功率仅为28.4%~60%，需要进一步优化培养体系提高成功率，且既往研究未建立大规模的OSCC PDO生物库用于系统研究顺铂耐药机制。对于顺铂耐药，既往研究已经发现肿瘤干细胞、上皮间质转化等都和耐药相关，但具体的关键调控靶点和可临床转化的逆转策略仍不明确。

本研究的创新价值体现在三个方面：一是优化了OSCC PDO培养体系，将建立成功率提高到70.77%，高于既往报道的最高成功率，并且成功构建了涵盖不同临床分期、不同解剖部位、不同分子亚型的OSCC PDO生物库；二是系统验证了该类器官生物库可用于基因操作、免疫肿瘤研究和药物筛选，且药物筛选结果和PDX体内结果高度一致，证明了其可靠性；三是首次明确CDCP1通过激活Wnt/β-连环蛋白通路增强肿瘤干细胞干性介导OSCC顺铂耐药，并开发了pH响应纳米颗粒递送siCDCP1的治疗方案，在顺铂耐药PDX模型中成功逆转耐药，且具有良好的生物安全性，为临床转化提供了新的思路。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标是构建能准确反映OSCC肿瘤异质性的PDO生物库，明确其应用价值，并筛选顺铂耐药的关键调控靶点，验证靶向该靶点逆转耐药的有效性。核心科学问题是优化后的PDO培养体系能否提高OSCC PDO建立成功率，构建的PDO能否保留亲本肿瘤的特征，以及CDCP1是否为OSCC顺铂耐药的关键调控因子。技术路线为：优化培养体系→建立PDO生物库→验证PDO保留亲本肿瘤特征→验证PDO的多场景应用能力→转录组筛选顺铂耐药靶点→机制验证→体内验证靶向治疗的有效性和安全性。

3.1 优化培养体系并建立OSCC PDO生物库

实验目的：优化OSCC PDO培养体系，提高建立成功率，构建能保留亲本肿瘤特征的OSCC PDO生物库。
方法细节：收集65例原发OSCC患者的新鲜手术/活检标本，对比三种不同配方的培养基，其中优化后的培养基3添加了LATS1/2抑制剂GA-017，评估不同培养基的类器官生长速率、长期扩增能力，对成功建立的PDO进行苏木素-伊红染色、免疫组化（IHC）、全外显子测序、转录组测序分析，验证其和亲本肿瘤的一致性，随后将PDO皮下接种到NCG小鼠体内，验证其致瘤能力和体内保留亲本肿瘤组织学特征的能力。
结果解读：生长曲线结果显示，添加GA-017的培养基3能显著促进类器官生长，获得最优的类器官形成效率和长期扩增能力（n=8）；机制上，GA-017通过抑制LATS1/2激活YAP，促进细胞增殖、自我更新和上皮间质转化，表现为增殖标记Ki-67表达升高，干细胞标记CD44、BMI1表达升高，上皮间质转化相关标记N-钙粘蛋白、波形蛋白表达升高，E-钙粘蛋白表达降低。最终本研究从65例标本中成功建立46株OSCC PDO，成功率为70.77%，这些PDO可以长期传代（超过10代）、冻存复苏，保留稳定的形态和转录组特征，生物库涵盖了不同年龄、性别、解剖部位、临床分期的标本。免疫组化结果显示，PDO和亲本肿瘤的上皮分化标记KRT5/6、基底细胞/干细胞标记TP63、增殖标记Ki67染色强度相关性分别为R=0.83（p<0.01，n=20）、R=0.85（p<0.01，n=20）、R=0.68（p<0.01，n=20），组织学特征也高度一致，保留了亲本肿瘤的分化异质性。基因组分析显示，PDO保留了亲本肿瘤的拷贝数变异、结构变异和体细胞突变，常见的抑癌基因TP53、TTN突变频率和TCGA-HNSCC队列一致。转录组分析显示，配对的PDO和亲本肿瘤转录组高度一致，且27株PDO涵盖了HNSCC的三种主要分子亚型（15株基底型，9株经典型，3株非典型），反映了临床OSCC的转录异质性。体内致瘤实验显示，3株测试的PDO接种12周后都能形成肉眼可见的肿瘤，组织学特征和分子标记表达都和亲本肿瘤一致。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用细胞培养、组织病理、测序类试剂/仪器。

3.2 验证PDO平台的多场景应用能力

实验目的：验证本研究构建的OSCC PDO生物库是否适用于基因操作、免疫肿瘤研究和药物筛选。
方法细节：基因操作方面，选择不同基础FOSL1表达的PDO，分别进行慢病毒介导的shRNA敲低和过表达，验证转染效率和对增殖能力的影响；免疫研究方面，分离同一患者外周血单个核细胞，体外激活得到效应T细胞，和自体PDO共培养，标记后动态观察T细胞对类器官的杀伤作用；药物筛选方面，随机选择20株PDO，检测顺铂、西妥昔单抗、多西他赛三种标准治疗药物的敏感性，随后选择两株不同药物敏感性的PDO对应的PDX模型，验证体外药物筛选结果和体内疗效的一致性。
结果解读：基因操作结果显示，转染效率高，FOSL1敲低后mRNA和蛋白水平显著降低，类器官增殖能力显著下降；FOSL1过表达则显著上调表达，增强类器官生长，证明该PDO平台适合基因操作和功能表型评估。免疫共培养结果显示，共培养10小时后就可以观察到类器官体积缩小，周边细胞溶解，出现明显的T细胞杀伤效应，证明该共培养平台可以用于模拟患者特异性肿瘤免疫相互作用，可用于免疫检查点抑制剂的疗效测试。药物筛选结果显示，20株PDO对三种药物的响应存在显著的患者间异质性，IC50、曲线下面积（AUC）都存在明显差异；进一步的PDX体内验证显示，顺铂耐药/西妥昔单抗敏感的PDO对应的PDX，西妥昔单抗治疗后肿瘤体积和重量显著降低（n=6，p<0.01），增殖减少，凋亡增加，顺铂则没有明显疗效；另一株顺铂耐药/多西他赛敏感的PDO对应的PDX也得到一致结果，证明PDO的药物筛选结果可靠，能准确预测体内药物响应。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用分子克隆、细胞功能检测、动物实验类试剂/仪器。

3.3 筛选并验证顺铂耐药的关键调控靶点及机制

实验目的：基于PDO生物库筛选顺铂耐药相关的关键调控分子，明确其作用机制。
方法细节：根据顺铂IC50将20株PDO分为顺铂敏感组（n=9，IC50<5μM）和顺铂耐药组（n=7，IC50>10μM），进行转录组测序，得到差异表达基因后和两个已发表的OSCC顺铂耐药数据集取交集，筛选候选靶点；随后在多个公共批量、单细胞转录组数据集验证CDCP1表达和顺铂耐药、患者预后的相关性，并用蛋白免疫印迹和免疫荧光验证耐药PDO中CDCP1的蛋白表达水平；进一步通过敲低、过表达结合功能实验，验证CDCP1对顺铂敏感性、肿瘤干细胞干性和Wnt/β-连环蛋白通路的调控作用。
结果解读：差异分析得到384个差异表达基因，和公共数据集取交集得到10个候选基因，其中CDCP1在耐药组显著高表达，且和患者不良预后正相关，被选为重点研究对象。公共数据库分析显示，CDCP1在治疗耐药的OSCC恶性上皮细胞中显著高表达，接受铂类治疗的TCGA-HNSCC队列中，CDCP1高表达患者总生存更差（HR=1.833，p=0.02）；蛋白水平验证显示，顺铂耐药PDO的CDCP1蛋白水平显著高于敏感PDO。功能实验显示，敲低CDCP1后，耐药PDO的顺铂IC50从20.12μM降至8.51μM，DNA损伤标记γ-H2AX增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白BAX表达升高，对顺铂的敏感性显著增加，且这种增敏效应仅在耐药PDO中显著。生物信息学分析显示，CDCP1表达和肿瘤干性评分正相关（R=0.33，p<0.01，TCGA-OSCC队列），顺铂耐药PDO的干性标记基础表达更高，敲低CDCP1后干性标记CD133、CD44、BMI1、SOX2表达显著降低。转录组富集分析显示，CDCP1调控的基因显著富集在Wnt通路，进一步机制验证显示，敲低CDCP1后总β-连环蛋白、细胞质β-连环蛋白、核β-连环蛋白都显著降低，Wnt通路活性降低；过表达CDCP1则显著增加总β-连环蛋白和核β-连环蛋白水平，增强Wnt通路转录活性，上调干性标记表达，促进肿瘤球形成，顺铂处理后增殖能力更强；激活Wnt通路可以逆转CDCP1敲低带来的干性降低和顺铂敏感性增加，证明CDCP1通过激活Wnt/β-连环蛋白通路增强肿瘤干细胞干性，介导顺铂耐药。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用转录组测序、分子生物学、细胞功能类试剂/仪器。

3.4 体内验证纳米颗粒靶向CDCP1逆转顺铂耐药

实验目的：验证纳米颗粒递送siCDCP1能否在体内逆转顺铂耐药，评估其生物安全性。
方法细节：制备pH响应的壳聚糖/γ-聚谷氨酸纳米颗粒包裹siCDCP1，表征纳米颗粒的粒径、电位、siRNA释放效率和细胞摄取效率；建立两株顺铂耐药的PDX模型，分别给予对照纳米颗粒、siCDCP1纳米颗粒、顺铂、siCDCP1纳米颗粒联合顺铂治疗，18天后观察肿瘤生长情况，检测肿瘤组织中相关蛋白的表达，同时评估小鼠体重、血常规、血生化和主要器官组织学，验证纳米颗粒的生物安全性。
结果解读：纳米颗粒平均粒径为107.8nm，zeta电位为18.08mV，在酸性条件（pH6.5）下24小时释放超过80%的siRNA，能有效被肿瘤细胞摄取，敲低CDCP1表达的效率和传统转染试剂相当。体内治疗结果显示，siCDCP1纳米颗粒单药就能显著降低肿瘤负荷，联合顺铂能实现肿瘤消退，肿瘤体积和重量都显著低于顺铂单药或对照纳米颗粒单药组（n=6，p<0.05）；肿瘤组织分析显示，联合治疗组CDCP1、β-连环蛋白、Ki67、CD44、BMI1表达显著降低，凋亡增加。安全性评估显示，治疗期间各组小鼠体重没有显著差异，治疗后血常规、血生化指标和主要器官组织学都没有明显异常，证明该纳米颗粒具有良好的体内生物安全性。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用纳米材料制备、动物体内治疗、组织病理检测类试剂/仪器。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究鉴定的生物标志物是CDCP1，是OSCC顺铂耐药相关的预测和预后生物标志物，筛选逻辑为：基于本研究构建的OSCC PDO生物库，按顺铂敏感性分组进行转录组测序，得到差异表达基因后和两个已发表的OSCC顺铂耐药公共数据集取交集，随后在多个公共批量、单细胞转录组数据集和本研究的PDO样本中验证CDCP1表达和顺铂耐药的相关性，再通过功能实验验证其调控耐药的作用。

CDCP1的表达验证来源为OSCC PDO和公共临床数据集，验证方法包括转录组测序、蛋白免疫印迹、免疫荧光和公共数据库生存分析。结果显示，顺铂耐药PDO中CDCP1 mRNA和蛋白表达都显著高于敏感PDO，TCGA-HNSCC队列中，CDCP1高表达和接受铂类治疗患者的不良总预后相关（HR=1.833，p=0.02，n=数百例）。

核心成果：CDCP1是OSCC顺铂耐药的关键调控因子，CDCP1高表达可作为顺铂耐药的预测生物标志物，也可作为逆转顺铂耐药的治疗靶点；机制上，CDCP1通过激活Wnt/β-连环蛋白通路增强肿瘤干细胞干性，介导顺铂耐药；本研究开发的pH响应纳米颗粒递送siCDCP1能有效沉默CDCP1表达，在顺铂耐药PDX模型中联合顺铂可实现肿瘤消退，且具有良好的生物安全性，为OSCC顺铂耐药的临床干预提供了新的可转化策略。