减毒沙门氏菌分泌白细胞介素-21，可激活T细胞并诱导抗肿瘤效应

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Attenuated Salmonella secreting interleukin-21 activates T-cells and induces anti-tumor effects；
发表期刊：文献未明确提供；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤免疫治疗、细菌介导的靶向癌症治疗

肿瘤治疗领域经历了从传统手术、放化疗到免疫治疗的迭代，2010年免疫检查点抑制剂（ICI）如PD-1/PD-L1抗体的获批成为关键突破，但仅10%-30%的患者能获得长期疗效，核心瓶颈在于免疫抑制性肿瘤微环境（TME）限制T细胞激活。细菌介导的癌症治疗近年复兴，减毒沙门氏菌因能选择性定植于肿瘤缺氧、免疫抑制区域，通过直接毒性、营养竞争及诱导免疫反应发挥抗肿瘤作用，但单独使用难以完全抑制肿瘤生长。白介素-21（IL-21）作为重要的免疫调节剂，可激活CD4+、CD8+T细胞及自然杀伤（NK）细胞，增强细胞毒性，联合ICI能提升疗效，但全身给药存在严重副作用，缺乏靶向递送系统。当前研究空白在于缺乏可安全靶向肿瘤微环境、局部递送IL-21并协同ICI增强抗肿瘤免疫的有效平台，因此本研究旨在构建分泌IL-21的减毒沙门氏菌，验证其体内抗肿瘤效果、免疫激活机制及联合抗PD-L1的协同效应，为肿瘤免疫治疗提供新策略。

2. 文献综述解析

作者以“传统治疗局限性→免疫治疗瓶颈→细菌治疗复兴→IL-21免疫调节潜力”为评述逻辑，系统梳理了肿瘤治疗领域的现状与未解决问题，进而引出本研究的创新方向。

现有研究方面，传统手术、放化疗虽对部分肿瘤有效，但约半数患者疗效有限且副作用显著；ICI治疗通过阻断免疫检查点恢复T细胞功能，但受限于免疫抑制性TME，响应率仅10%-30%；减毒沙门氏菌能靶向肿瘤微环境，但其单独应用难以实现完全肿瘤抑制，且缺乏改造以递送高效免疫调节剂的成熟策略；IL-21可增强CD8+T细胞的细胞毒性，联合ICI具有协同抗肿瘤效应，但全身给药易引发系统性炎症等严重副作用，无法实现肿瘤局部的精准激活。

本研究的创新价值在于，针对现有研究中“IL-21全身给药毒性大、沙门氏菌单独抗肿瘤效果有限、ICI响应率低”的核心问题，首次构建了通过III型分泌系统（FT3SS）分泌FlgM标签化IL-21的减毒沙门氏菌，实现了肿瘤靶向的IL-21局部递送，既避免了全身毒性，又能激活肿瘤微环境中的T细胞，同时联合抗PD-L1抗体进一步提升了抗肿瘤效果与生存率，为肿瘤免疫治疗提供了安全有效的靶向联合策略。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体目标是构建可诱导分泌IL-21的减毒沙门氏菌菌株，验证其体内肿瘤靶向性、生物安全性、单药抗肿瘤效果及免疫激活机制，并探索其与抗PD-L1抗体联合治疗的协同效应；核心科学问题为“靶向递送的IL-21能否有效激活肿瘤微环境中的T细胞，克服免疫抑制并协同ICI增强抗肿瘤免疫”；技术路线遵循“菌株构建→体外功能验证→体内靶向性与安全性验证→单药抗肿瘤效果与免疫机制研究→联合治疗协同效应验证”的闭环逻辑。

3.1 分泌IL-21的沙门氏菌菌株构建与体外功能验证

实验目的为构建可通过L-阿拉伯糖诱导分泌IL-21的减毒沙门氏菌菌株，并验证其IL-21分泌功能、生长特性及运动性。方法细节上，以BRD509（aroA、aroD基因缺失的减毒沙门氏菌SL1344突变株）为基础，通过lambda介导的靶向诱变技术删除rcsB基因，再利用P22噬菌体转导构建aroA、aroD、asd、rcsB基因缺失的菌株；同时构建FlgM-8×His-mIL-21融合基因，经密码子优化后克隆至含PBAD阿拉伯糖诱导启动子的pBAD18载体，插入flhDC基因以增强分泌能力、asd基因以维持质粒稳定性，将重组质粒转化至上述缺失菌株获得目标菌株。体外培养时，待菌株OD600达0.2时加入0.2% L-阿拉伯糖诱导6小时，收集全细胞、细胞裂解液及上清，采用免疫印迹（Western blot）检测IL-21表达，ELISA定量分泌水平，同时检测菌株生长曲线及运动性。结果解读显示，免疫印迹结果表明诱导后上清中出现约25kDa的IL-21特异性条带；ELISA检测显示诱导组IL-21分泌水平显著高于非诱导组（n=5，P<0.0001）；生长曲线显示阿拉伯糖诱导不影响菌株正常生长；时间梯度免疫印迹显示IL-21分泌量随诱导时间增加；运动性实验显示诱导后菌株运动性降低，证实菌株可在诱导下稳定分泌IL-21且生物学特性可控。

实验所用关键产品：Takara Bio Inc.的NheI（#1241A）、SacI（#1078A）、SalI（#1080A）、ClaI（#1034A）限制性内切酶；SouthernBiotech的抗His标签抗体（#SB194b）；R&D Systems的抗小鼠IL-21抗体（#MAB594）；Cell Signaling Technology的HRP标记抗小鼠IgG（#7076）；Abcam的HRP标记抗大鼠IgG（#AB97057）；Proteintech的小鼠IL-21 ELISA试剂盒（KE10012）。

3.2 分泌IL-21的沙门氏菌体内抗肿瘤效果验证

实验目的为验证该重组菌株在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果及生物安全性。方法细节上，构建BALB/c小鼠皮下CT26结肠癌细胞模型，待肿瘤体积达100-150mm³时，尾静脉注射2×10^7 CFU的重组菌株，3天后开始每日腹腔注射80mg/只L-阿拉伯糖以诱导IL-21分泌；设置PBS对照组、沙门氏菌单独组、无诱导组及诱导组，每周两次监测肿瘤体积、小鼠体重及生存率，21天后取肿瘤组织进行TUNEL凋亡检测与Ki-67增殖检测。结果解读显示，诱导组肿瘤体积随时间显著小于其他组（n=7，P<0.01）；诱导组小鼠生存率较PBS组提升70%，较沙门氏菌单独组及无诱导组提升57.14%；TUNEL检测显示诱导组肿瘤细胞凋亡率显著升高（n=3，P<0.001）；Ki-67免疫组化显示诱导组肿瘤细胞增殖活性显著降低（n=3，P<0.01）；小鼠体重在注射后5天内恢复稳定，无明显下降，证实菌株具有显著的抗肿瘤效果且安全性良好。

实验所用关键产品：Bio X cell的抗PD-L1抗体（200μg/只）；Abcam的TUNEL Assay Kit-HRP-DAB（#AB206386）；Cell Signaling Technology的抗Ki-67抗体（#12202）；Dako的DAB检测系统（K3468）。

3.3 分泌IL-21的沙门氏菌对肿瘤微环境T细胞的激活作用

实验目的为探究重组菌株通过分泌IL-21激活肿瘤浸润T细胞的免疫机制。方法细节上，荷瘤小鼠注射菌株7天后，取肿瘤组织制备单细胞悬液，采用流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞的比例；通过ELISA检测肿瘤组织中IL-21的浓度；采用免疫组化（IHC）及免疫荧光（IF）检测IL-21在肿瘤中的表达、T细胞浸润情况，以及CD8+T细胞中颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ的表达水平。结果解读显示，ELISA检测显示诱导组肿瘤组织中IL-21浓度为147pg/mL，而对照组未检测到IL-21（n=3，P<0.001）；流式细胞术结果显示诱导组肿瘤中CD4+、CD8+T细胞的比例显著高于其他组（n=3，P<0.05）；免疫荧光检测显示诱导组肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞的浸润数量显著增加（n=3，P<0.05）；CD8+T细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达水平显著升高（n=3，P<0.01），证实IL-21可有效激活肿瘤微环境中的T细胞，增强其细胞毒性。

实验所用关键产品：eBioscience的抗CD3-PE-eF610（61-0031-82）、抗CD4-PerCP（46-0041-82）、抗CD8-AF700（56-0081-82）、抗FVD-APC-Cy7（65-0865-14）流式抗体；Abcam的抗CD4抗体（#183685）、抗CD8α抗体（#AB22378）、抗IFN-γ抗体（#133566）；Cell Signaling Technology的抗颗粒酶B抗体（#17215S）、抗穿孔素抗体（#44865S）；Zeiss共聚焦显微镜。

3.4 分泌IL-21的沙门氏菌联合抗PD-L1的协同抗肿瘤效果

实验目的为验证重组菌株与抗PD-L1抗体联合治疗的协同抗肿瘤效应。方法细节上，在BALB/c小鼠CT26肿瘤模型中，尾静脉注射重组菌株的同时，于0、3、6、9天腹腔注射200μg/只抗PD-L1抗体，3天后开始每日腹腔注射L-阿拉伯糖诱导IL-21分泌；监测各组小鼠的肿瘤体积、体重及生存率，21天后取肿瘤组织进行TUNEL凋亡检测与Ki-67增殖检测。结果解读显示，联合治疗组的肿瘤体积显著小于单药治疗组，且40%的小鼠实现了完全肿瘤消退（n=5，P<0.0001）；联合治疗组的小鼠生存率显著高于单药组；TUNEL检测显示联合组肿瘤细胞凋亡率显著高于单药组（n=3，P<0.0001）；Ki-67免疫组化显示联合组肿瘤细胞增殖活性显著降低（n=3，P<0.01）；小鼠体重全程保持稳定，证实联合治疗具有显著的协同效应且安全性良好。

实验所用关键产品同前述抗PD-L1抗体、TUNEL试剂盒及Ki-67抗体。

3.5 分泌IL-21的沙门氏菌体内靶向性与安全性验证

实验目的为验证重组菌株的肿瘤靶向性及体内生物安全性。方法细节上，向荷瘤小鼠尾静脉注射携带luxCDABE荧光报告基因的重组菌株，采用IVIS成像系统在注射后2、24、48、168、336小时检测体内荧光分布；在注射后1、7、14天取肿瘤及主要器官（心、肝、脾、肺、肾），涂布LB平板进行菌落计数；在注射后7、14、21天采集血清，检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）等生化指标，并对组织进行H&E病理染色。结果解读显示，IVIS成像仅在肿瘤部位检测到荧光信号，其他器官无荧光分布；菌落计数显示沙门氏菌仅在肿瘤组织中积累，其他器官未检测到菌落（n=3）；血清生化指标均处于正常范围（n=3）；H&E病理染色显示正常组织无明显病变，脾脏出现短暂肿大后恢复正常，证实菌株具有高度的肿瘤靶向性及良好的体内安全性。

实验所用关键产品：Addgene的pGEN-luxCDABE质粒（#44918）；IVIS活体成像系统。

4. Biomarker研究及发现成果解析

本研究围绕肿瘤免疫激活与治疗安全性，系统探究了肿瘤微环境中的免疫相关Biomarker及血清安全性Biomarker，明确了IL-21介导的免疫激活与抗肿瘤效果的关联，为治疗策略的临床转化提供了依据。

Biomarker定位方面，本研究涉及的Biomarker分为两类：一是免疫激活类Biomarker，包括肿瘤微环境中的IL-21、CD4+T细胞、CD8+T细胞、颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ，用于评估免疫激活水平与抗肿瘤效果；二是安全性Biomarker，包括血清中的ALT、AST、BUN、CREA，用于评估菌株的体内毒性。筛选与验证逻辑为：IL-21先通过体外分泌实验验证，再通过肿瘤组织ELISA、免疫组化、免疫荧光验证其体内表达；T细胞及效应分子通过流式细胞术、免疫荧光验证其在肿瘤微环境中的水平；安全性Biomarker通过血清生化检测及组织病理染色验证。

研究过程详述：IL-21来源于重组沙门氏菌的分泌，在肿瘤组织中的浓度经ELISA定量为147pg/mL（n=3，P<0.001），免疫组化及免疫荧光染色证实其在肿瘤微环境中的特异性表达；CD4+、CD8+T细胞的比例经流式细胞术检测，诱导组较对照组显著升高（n=3，P<0.05）；CD8+T细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达经免疫荧光定量，诱导组较对照组显著升高（n=3，P<0.01）；血清安全性Biomarker在注射后7、14、21天检测，ALT、AST、BUN、CREA均处于正常参考范围内（n=3），无明显异常升高。

核心成果提炼：IL-21作为核心免疫激活Biomarker，其在肿瘤微环境中的表达与CD4+、CD8+T细胞的浸润水平、CD8+T细胞效应分子的表达水平呈正相关，与肿瘤体积呈负相关，可作为评估治疗效果的关键指标；本研究首次证实，肿瘤靶向递送的IL-21可有效激活肿瘤微环境中的T细胞，联合抗PD-L1抗体后40%的荷瘤小鼠实现完全肿瘤消退，生存率显著提升；统计学结果显示，IL-21分泌水平（n=5，P<0.0001）、T细胞比例（n=3，P<0.05）、效应分子表达（n=3，P<0.01）、联合治疗的肿瘤体积抑制率（n=5，P<0.0001）均具有显著统计学差异，为该治疗策略的有效性提供了严谨的数据支持。