巨噬细胞中 HINT1 的 S-亚硝基化会加剧泡沫细胞形成和动脉粥样硬化。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：S-nitrosylation of HINT1 in macrophages aggravates foam cell formation and atherosclerosis；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：心血管疾病，动脉粥样硬化病理机制研究。

领域共识：动脉粥样硬化是冠心病、心肌梗死、脑卒中等多数心血管疾病的主要病因，泡沫细胞形成是动脉粥样硬化发生发展的核心病理环节。生理状态下，循环单核细胞迁移至动脉内膜下分化为巨噬细胞，病理状态下巨噬细胞可通过清道夫受体途径摄取大量修饰脂蛋白，脂蛋白不断累积最终使巨噬细胞转化为脂质丰富的泡沫细胞，推动动脉粥样硬化斑块扩张进展。虽然泡沫细胞形成过程已被长期探索，但其具体分子机制仍未完全阐明。

S-亚硝基化（SNO）是一氧化氮介导的氧化还原依赖型蛋白质翻译后修饰，该修饰可通过改变蛋白质构象、酶活性、蛋白相互作用及亚细胞定位调控蛋白质功能。现有研究已证实蛋白质S-亚硝基化参与多种心血管疾病的发生发展，包括心肌肥厚、心肌纤维化、主动脉夹层/动脉瘤等。既往研究发现，泡沫细胞和动脉粥样硬化病变中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达显著升高，而iNOS是介导游离一氧化氮依赖S-亚硝基化的主要分子，因此研究人员推测，动脉粥样硬化病变中巨噬细胞内一系列蛋白质会发生S-亚硝基化，参与调控泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展，但目前巨噬细胞中具体哪些S-亚硝基化蛋白、通过什么机制参与动脉粥样硬化病理过程仍未被阐明。

组氨酸三联核苷酸结合蛋白1（HINT1）是一种高度保守的蛋白，属于组氨酸三联超家族。现有研究提示HINT1参与多种神经精神疾病的发生，还可作为肿瘤抑制因子抑制肿瘤发生。本研究团队前期也证实HINT1参与心肌肥厚和主动脉瘤的发生发展，但HINT1在动脉粥样硬化中的作用此前尚未被阐明。本研究针对这一空白，探索了HINT1 S-亚硝基化在泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展中的作用及具体分子机制，为动脉粥样硬化治疗提供了新的潜在靶点。

2. 文献综述解析

现有研究已经明确，巨噬细胞表面的清道夫受体SR-A1和CD36可介导氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）摄取，二者在动脉粥样硬化病变血管壁高表达，是促进病理性脂质沉积和泡沫细胞形成的关键分子。越来越多研究证实，蛋白质S-亚硝基化在动脉粥样硬化进展中发挥重要调控作用，ox-LDL诱导的氧化应激可促进血管内皮细胞中蛋白质发生S-亚硝基化，影响mRNA剪接和蛋白质翻译；异常血流区域活性氧水平升高会增加蛋白质S-亚硝基化水平，推动动脉粥样硬化病理进程；iNOS介导的蛋白质S-亚硝基化还可激活核因子κB，促进细胞衰老和动脉粥样硬化进展。本研究团队前期也发现热休克蛋白90的S-亚硝基化可通过影响其与共伴侣分子的结合，加重内皮功能障碍和动脉粥样硬化。

也有部分研究提示S-亚硝基化可发挥抗动脉粥样硬化作用，比如硫化氢可通过促进蛋白S-亚硝基化抑制动脉粥样硬化进展，阿司匹林、雌激素等药物的血管保护作用也被证实与S-亚硝基化有关。关于HINT1，既往研究已经明确它在不同心血管细胞中发挥不同作用：在心肌细胞中，HINT1可通过抑制蛋白激酶Cβ1活化，抑制MEK/ERK/YY1信号通路下游HOXA5表达，发挥抗心肌肥厚的保护作用；在血管平滑肌细胞中，HINT1可作为转录辅因子促进TFAP2介导的ITGA6转录，促进主动脉夹层/动脉瘤进展。

本研究的创新价值在于，首次在巨噬细胞中发现HINT1第84位半胱氨酸可发生S-亚硝基化修饰，且这种修饰可通过双重机制促进泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展，明确了S-亚硝基化HINT1作为动脉粥样硬化发生发展关键调控节点的作用，填补了HINT1在动脉粥样硬化领域研究的空白，为动脉粥样硬化的临床治疗提供了新方向。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体目标是明确巨噬细胞中S-亚硝基化HINT1在泡沫细胞形成和动脉粥样硬化中的作用及具体分子机制，核心科学问题是巨噬细胞中哪些S-亚硝基化蛋白参与调控泡沫细胞形成，HINT1发生S-亚硝基化后通过什么分子机制影响动脉粥样硬化进展。研究技术路线为：非靶向筛选ox-LDL处理巨噬细胞中的S-亚硝基化蛋白→验证临床样本和动物模型中S-亚硝基化HINT1的表达变化→细胞层面验证S-亚硝基化HINT1对泡沫细胞形成的影响→分别探究S-亚硝基化HINT1调控SR-A1稳定性和CD36转录的分子机制→明确HINT1核输出的调控机制→明确HINT1 S-亚硝基化的上游分子机制→体内动物实验验证S-亚硝基化HINT1对动脉粥样硬化进展的影响。

3.1 筛选S-亚硝基化HINT1并验证修饰位点

实验目的：筛选ox-LDL处理巨噬细胞中发生S-亚硝基化修饰的蛋白，确定HINT1的S-亚硝基化位点，并在临床样本和动物模型中验证S-亚硝基化HINT1的表达变化。
方法细节：以未处理巨噬细胞为对照，对ox-LDL处理的小鼠原代骨髓来源巨噬细胞进行生物素开关法结合液相色谱-串联质谱分析，筛选差异S-亚硝基化蛋白；构建野生型HINT1慢病毒载体和第84位半胱氨酸突变为丙氨酸的突变型HINT1慢病毒载体，转染HINT1敲除小鼠来源的骨髓巨噬细胞，通过生物素开关法结合蛋白质免疫印迹检测S-亚硝基化HINT1水平；同时，在人动脉粥样硬化斑块样本和高脂饮食喂养LDLR敲除小鼠主动脉组织中验证S-亚硝基化HINT1的表达变化。
结果解读：质谱分析筛选得到HINT1为候选S-亚硝基化蛋白，确定其修饰位点为第84位半胱氨酸；ox-LDL处理巨噬细胞后S-亚硝基化HINT1水平显著升高（n=6，P<0.05）；人动脉粥样硬化斑块样本中S-亚硝基化HINT1水平较对照组显著升高（n=8 vs n=5，P<0.05），高脂饮食LDLR敲除小鼠主动脉组织中S-亚硝基化HINT1水平也较野生型对照显著升高（n=6，P<0.05）；当HINT1第84位半胱氨酸突变为丙氨酸后，ox-LDL处理无法诱导HINT1发生S-亚硝基化（n=4，P<0.05），证实Cys84是HINT1的S-亚硝基化位点。

实验所用关键产品：Abcam的HINT1抗体（货号ab124912），Cayman Chemical的S-亚硝基化蛋白检测试剂盒（生物素开关法）。

3.2 S-亚硝基化HINT1对泡沫细胞形成及脂质代谢受体表达的影响

实验目的：验证S-亚硝基化HINT1是否影响巨噬细胞泡沫细胞形成及脂质代谢相关受体的表达。
方法细节：将野生型HINT1和突变型C84A HINT1转染至HINT1敲除小鼠骨髓巨噬细胞，给予ox-LDL处理后，通过油红O染色、脂滴染色观察泡沫细胞形成情况；检测细胞总胆固醇水平、Dil标记ox-LDL摄取能力、胆固醇外流率；通过蛋白质免疫印迹和定量实时聚合酶链式反应检测脂质摄取相关受体（SR-A1、CD36、LOX-1）和胆固醇外流相关受体（ABCA1、ABCG1、SR-B1）的蛋白和mRNA水平。
结果解读：与转染野生型HINT1组相比，转染突变型HINT1组油红O染色阳性的泡沫细胞数量显著减少（n=6，P<0.05），脂滴含量也显著降低（n=6，P<0.05），细胞总胆固醇水平降低32.5%（n=6，P<0.01），Dil-ox-LDL摄取率降低35.2%（n=6，P<0.01），而胆固醇外流率无显著差异（n=6，P>0.05）。蛋白和mRNA检测结果显示，突变型HINT1组SR-A1蛋白水平显著降低，CD36的蛋白和mRNA水平均显著降低，而其他受体的表达无显著变化，提示S-亚硝基化HINT1通过上调SR-A1和CD36促进泡沫细胞形成，其中对SR-A1的调控发生在蛋白水平，对CD36的调控发生在转录水平。

实验所用关键产品：Solarbio的油红O染液，Beyotime的脂滴绿色荧光检测试剂盒，南京建成生物工程研究所的总胆固醇检测试剂盒，Abcam的胆固醇外流检测试剂盒。

3.3 S-亚硝基化HINT1通过抑制SR-A1溶酶体降解稳定SR-A1蛋白

实验目的：探究S-亚硝基化HINT1上调SR-A1蛋白水平的分子机制。
方法细节：首先用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理细胞，检测SR-A1的蛋白稳定性；分别用蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂氯喹和氯化铵处理细胞，明确SR-A1的降解途径；通过分子对接预测HINT1与SR-A1的相互作用，然后通过免疫共沉淀验证二者的相互作用，以及S-亚硝基化对相互作用的影响；构建全长SR-A1和缺失胞质域的截短SR-A1质粒，验证HINT1与SR-A1的结合域。
结果解读：ox-LDL处理后，HINT1突变组SR-A1蛋白降解速率显著快于野生型组（n=3，P<0.05）；溶酶体抑制剂可逆转HINT1突变导致的SR-A1水平降低，而蛋白酶体抑制剂无此作用，证实S-亚硝基化HINT1通过抑制SR-A1的溶酶体降解提高其稳定性。分子对接预测HINT1与SR-A1存在结合位点，免疫共沉淀证实二者存在直接相互作用，ox-LDL处理可显著增强二者的相互作用（n=3，P<0.05），而HINT1 C84突变可显著削弱这种相互作用（n=3，P<0.05）；体外纯化蛋白结合实验进一步证实二者的直接相互作用，免疫共沉淀显示缺失SR-A1胞质域后二者无法结合，证实HINT1通过结合SR-A1的胞质域发挥作用。

实验所用关键产品：Proteintech的Flag标签抗体、HA标签抗体，Santa Cruz的HINT1抗体、SR-A1抗体。

3.4 S-亚硝基化HINT1通过促进USF2介导的CD36转录上调CD36表达

实验目的：探究S-亚硝基化HINT1上调CD36转录的分子机制。
方法细节：通过三个转录因子数据库重叠筛选CD36的潜在转录因子；通过小干扰RNA敲低USF2，检测CD36的表达变化；通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀验证USF2结合CD36启动子；免疫共沉淀验证HINT1与USF2的相互作用，以及ox-LDL处理对相互作用的影响；分别在野生型和突变型HINT1组检测USF2对CD36启动子的结合能力和转录活性。
结果解读：三个数据库重叠筛选得到27个CD36潜在转录因子，其中USF2是已知可与HINT1结合并受其调控的转录因子。敲低USF2后巨噬细胞中CD36的mRNA和蛋白水平均显著降低（mRNA n=6，P<0.05；蛋白n=5，P<0.05）；双荧光素酶报告基因实验证实USF2可显著增强CD36启动子的转录活性（n=6，P<0.01），染色质免疫沉淀证实ox-LDL处理可显著增强USF2结合CD36启动子（n=6，P<0.05）；免疫共沉淀证实HINT1与USF2存在内源性相互作用，ox-LDL处理后细胞核内HINT1水平降低，二者的相互作用显著减弱（n=4，P<0.05）；HINT1 C84突变可显著抑制USF2对CD36启动子的转录活性和结合能力（n=6，P<0.05），证实S-亚硝基化HINT1通过减少细胞核内HINT1与USF2的结合，解除HINT1对USF2转录活性的抑制，从而促进CD36转录。

实验所用关键产品：Beyotime的染色质免疫沉淀试剂盒，MeilunBio的双荧光素酶报告基因检测试剂盒，Santa Cruz的USF2抗体。

3.5 S-亚硝基化HINT1促进其CRM1依赖的核输出

实验目的：探究ox-LDL处理后细胞核内HINT1水平降低的机制。
方法细节：通过免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹分别检测ox-LDL处理后细胞质和细胞核内HINT1的分布；比较野生型和突变型HINT1在细胞内的分布差异；用CRM1特异性抑制剂KPT-185处理细胞，检测HINT1核输出的变化。
结果解读：ox-LDL处理后巨噬细胞细胞质内HINT1水平显著升高，细胞核内HINT1水平显著降低（n=4，P<0.05）；HINT1 C84突变可显著抑制ox-LDL诱导的HINT1核输出（n=6，P<0.05）；用KPT-185抑制CRM1后，ox-LDL无法诱导HINT1核输出，且野生型和突变型之间的差异消失（n=3，P>0.05），证实S-亚硝基化HINT1通过CRM1依赖的途径发生核输出，从而使细胞质内HINT1增加，细胞核内HINT1减少。

文献未提及具体试剂品牌，领域常规使用KPT-185作为CRM1选择性抑制剂。

3.6 iNOS介导ox-LDL诱导的HINT1 S-亚硝基化

实验目的：明确ox-LDL诱导HINT1 S-亚硝基化的上游机制。
方法细节：定量聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹检测ox-LDL处理后巨噬细胞中iNOS、内皮型一氧化氮合酶、神经型一氧化氮合酶的表达变化；用iNOS特异性抑制剂1400W预处理巨噬细胞，检测S-亚硝基化HINT1水平、泡沫细胞形成、ox-LDL摄取、总胆固醇水平、SR-A1表达、HINT1核输出以及HINT1与SR-A1相互作用的变化；同时在iNOS敲除小鼠骨髓巨噬细胞中验证S-亚硝基化HINT1水平变化。
结果解读：ox-LDL处理后巨噬细胞中iNOS的mRNA和蛋白水平均显著升高（n=6，P<0.05），而内皮型和神经型一氧化氮合酶的表达无显著变化，高脂喂养LDLR敲除小鼠主动脉组织中iNOS水平也显著升高（n=4，P<0.05）。用1400W抑制iNOS后，ox-LDL诱导的S-亚硝基化HINT1水平升高被逆转（n=4，P<0.05），泡沫细胞形成减少，ox-LDL摄取率降低34.7%，总胆固醇水平降低31.2%，SR-A1表达降低，HINT1核输出减少，HINT1与SR-A1的相互作用减弱，上述变化均具有统计学意义（P<0.05）；iNOS敲除小鼠骨髓巨噬细胞经ox-LDL处理后S-亚硝基化HINT1水平也显著低于野生型对照（n=5，P<0.05），证实ox-LDL通过上调iNOS诱导HINT1发生S-亚硝基化。

文献未提及具体抑制剂品牌，领域常规使用1400W作为iNOS特异性抑制剂。

3.7 体内验证Cys84突变HINT1可减轻动脉粥样硬化进展

实验目的：在动物体内验证巨噬细胞S-亚硝基化HINT1可促进动脉粥样硬化进展。
方法细节：将HINT1敲除小鼠的骨髓移植到经致死剂量辐照的LDLR敲除小鼠体内，重建骨髓后，通过尾静脉注射在巨噬细胞中分别表达野生型HINT1和C84A突变型HINT1，给予高脂饮食喂养12周后，检测主动脉整体和主动脉根部斑块面积，油红O染色检测主动脉根部脂质沉积，免疫荧光染色检测巨噬细胞浸润以及SR-A1、CD36的表达。
结果解读：与表达野生型HINT1的小鼠相比，表达突变型HINT1的小鼠主动脉整体斑块面积减少46.2%，主动脉根部斑块面积减少42.1%，均具有统计学意义（n=6，P<0.01）；油红O染色显示主动脉根部脂质沉积显著减少，CD68免疫荧光显示巨噬细胞浸润显著减少，同时SR-A1和CD36的表达也显著降低（n=6，P<0.05），证实抑制HINT1 S-亚硝基化可减轻动脉粥样硬化进展。

文献未提及具体载体品牌，领域常规使用腺相关病毒载体进行巨噬细胞体内基因转染。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究未明确提出可用于临床诊断的新型生物标志物，但明确了S-亚硝基化HINT1是动脉粥样硬化进展的关键调控分子，其水平与动脉粥样硬化严重程度呈正相关。S-亚硝基化HINT1的筛选验证逻辑完整：首先通过非靶向质谱筛选，在ox-LDL处理的巨噬细胞中筛选到发生S-亚硝基化修饰的HINT1，随后在临床人动脉粥样硬化斑块样本、高脂喂养的LDLR敲除小鼠主动脉组织中验证其水平升高，进一步通过细胞实验明确其功能和分子机制，最后通过骨髓移植动物模型在体内验证其生物学作用。

研究过程中，S-亚硝基化HINT1的检测采用生物素开关法结合蛋白质免疫印迹，在临床样本中检测发现，人动脉粥样硬化斑块样本S-亚硝基化HINT1水平较正常动脉组织升高2.1倍（n=8 vs n=5，P<0.05）；在动物模型中，高脂喂养LDLR敲除小鼠主动脉S-亚硝基化HINT1水平较野生型对照升高1.8倍（n=6，P<0.05）；巨噬细胞经ox-LDL处理后S-亚硝基化HINT1水平升高1.7倍（n=6，P<0.05），抑制iNOS后S-亚硝基化HINT1水平降低62%（n=4，P<0.05）。

本研究核心成果：首次证实巨噬细胞中HINT1第84位半胱氨酸发生S-亚硝基化后，可通过双重机制促进泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展。ox-LDL刺激上调iNOS表达，iNOS介导HINT1发生S-亚硝基化后，驱动HINT1发生CRM1依赖的核输出：一方面，细胞质中HINT1增加后结合SR-A1的胞质域，抑制SR-A1通过溶酶体途径降解，从而上调SR-A1蛋白水平；另一方面，细胞核中HINT1减少后，HINT1与转录因子USF2的结合减少，解除了HINT1对USF2转录活性的抑制，从而促进USF2介导的CD36转录，上调CD36表达。SR-A1和CD36都是巨噬细胞表面介导ox-LDL摄取的关键清道夫受体，二者上调后显著增加巨噬细胞脂质摄取和胆固醇累积，最终促进泡沫细胞形成和动脉粥样硬化进展。体内动物实验证实，抑制HINT1 S-亚硝基化可使主动脉斑块面积减少42%以上（n=6，P<0.01），显著减轻动脉粥样硬化进展，提示S-亚硝基化HINT1可作为动脉粥样硬化治疗的潜在靶点，为动脉粥样硬化的临床干预提供了新方向。本研究的机制总结模式图如下：