通过单核转录组学解码脂肪细胞异质性，揭示了亚型特异性脂肪细胞在乳腺癌中协调免疫抑制微环境。
Decoding adipocyte heterogeneity through single-nucleus transcriptomics unveils subtype-specific adipocytes orchestrate immunosuppressive niches in breast cancer.
1. 领域背景与文献
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：乳腺癌肿瘤微环境异质性研究
领域共识：乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，2022年新增病例超过200万，死亡病例超过66万。目前根据雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2的表达，将乳腺癌分为管腔型、人表皮生长因子受体2富集型、三阴性乳腺癌三种分子亚型，分子亚型是独立于肿瘤分期的预后和治疗预测指标。随着多组学技术的发展，乳腺癌研究逐渐转向精准医学，研究热点也从肿瘤细胞本身拓展到整个肿瘤微环境。
乳腺肿瘤微环境的标志性特征是脂肪细胞占乳腺间质体积的大部分，这是乳腺癌区别于其他实体瘤的核心特点。已有研究证实癌相关脂肪细胞与肿瘤细胞存在双向互作：一方面肿瘤细胞会改变癌相关脂肪细胞的形态和功能，使其呈现去分化特征并改变分泌功能；另一方面癌相关脂肪细胞分泌的脂肪因子、细胞因子、基质金属蛋白酶和代谢物，反过来调控肿瘤细胞和其他肿瘤微环境细胞，为肿瘤进展提供能量并抑制抗肿瘤免疫应答。但由于癌相关脂肪细胞存在高度异质性，这种双向互作的具体机制仍不明确。
常规单细胞RNA测序技术虽然提升了对乳腺正常组织和肿瘤微环境细胞异质性的认知，但由于脂肪细胞本身细胞脆弱、脂滴体积大，解离过程易受机械损伤，常规单细胞技术应用存在明显技术瓶颈。单核RNA测序仅提取细胞核进行分析，能够在单细胞分辨率解析脂肪细胞的复杂性，突破了上述技术限制。已有研究利用单核RNA测序对比了乳腺癌患者癌旁和正常脂肪组织，发现癌相关脂肪细胞相较于正常脂肪细胞脂摄取表型降低，呈现炎症状态，但目前在单细胞层面针对乳腺特异性肿瘤微环境中脂肪细胞特征的研究仍然稀少，尚无研究同时解析乳腺癌中脂肪细胞和肿瘤细胞的异质性，因此明确不同分子亚型乳腺癌中脂肪细胞的异质性特征及其功能，对该领域发展具有重要学术价值。
2. 文献综述解析
作者围绕乳腺癌肿瘤微环境中脂肪细胞异质性的研究现状，从技术发展、现有研究发现两个维度展开评述。技术发展层面，作者指出常规单细胞RNA测序突破了批量测序的分辨率限制，推动了乳腺组织细胞异质性研究，但脂肪细胞自身的生物学特征（大体积、脂滴含量高、细胞膜脆弱）导致常规单细胞测序存在难以逾越的技术瓶颈，应用受到极大限制。而单核RNA测序技术通过仅分析细胞核规避了上述技术缺陷，为脂肪细胞异质性研究提供了可行的技术方案，这一技术突破推动了该领域的快速发展。
现有研究发现层面，已有研究已经证实癌相关脂肪细胞与肿瘤细胞的双向互作，明确了脂肪细胞在肿瘤进展、免疫抑制中的重要作用，部分研究已经利用单核RNA测序开展了乳腺癌脂肪细胞的初步研究，有团队发现乳腺癌会诱导脂肪细胞发生代谢重编程，从脂解表型转为脂生成表型；另有研究在皮下脂肪组织中鉴定出4种（前体）脂肪细胞亚群，其中脂联素阳性成熟脂肪细胞亚群与乳腺癌不良预后相关。但现有研究仅开展了正常与癌旁脂肪组织的初步对比，未结合乳腺癌不同分子亚型分析脂肪细胞的异质性分布和功能差异，也未系统解析脂肪细胞亚群与肿瘤浸润免疫细胞之间的细胞互作，无法阐明亚型特异性脂肪细胞在肿瘤微环境塑造中的作用，领域仍存在明确研究空白。
本研究的创新价值在于，首次在不同分子亚型乳腺癌中系统解析了脂肪细胞的细胞组成、功能异质性以及脂肪细胞与免疫细胞的细胞互作，明确了肿瘤特异性脂肪细胞亚群的分布特征和功能，填补了该领域的研究空白，为乳腺癌的预后判断和间质靶向治疗提供了新的潜在靶点，对推动乳腺癌肿瘤微环境研究具有重要学术意义。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的研究目标是构建乳腺癌脂肪细胞的单细胞图谱，明确不同分子亚型乳腺癌中脂肪细胞的异质性，阐明脂肪细胞亚群在塑造免疫抑制肿瘤微环境中的作用；核心科学问题是癌相关脂肪细胞的异质性特征，以及不同亚型特异性脂肪细胞如何通过与免疫细胞互作调控免疫抑制微环境；技术路线逻辑为：临床样本收集→单核RNA测序建库测序→公共数据整合→细胞聚类注释→亚群功能分析→细胞互作分析→免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）验证→癌症基因组图谱公共数据集验证，形成了从组学分析到实验验证的完整研究闭环。
3.1 样本收集与测序文库构建
实验目的：获取不同分子亚型乳腺癌患者的癌旁脂肪组织和健康供体正常乳腺脂肪组织，构建高质量的单核RNA测序文库用于后续分析。
方法细节：共收集9例初治原发性乳腺癌患者的癌相关脂肪组织（定义为距肿瘤边缘1cm内的脂肪组织），其中管腔型3例、人表皮生长因子受体2阳性3例、三阴性乳腺癌3例，收集3例非癌症供体的正常乳腺脂肪组织作为对照，另外收集额外临床样本用于免疫组化和免疫荧光验证。所有样本经液氮速冻后提取细胞核，通过梯度蔗糖纯化细胞核后，利用10x Genomics单细胞3’文库构建试剂盒构建文库，经定量和质检后进行双端150bp测序。同时收集符合纳入标准的公开皮下脂肪组织单核RNA测序数据集用于整合对比分析。
结果解读：所有文库质检合格，共获得133381个高质量细胞核用于后续分析，其中46852个细胞核来自正常脂肪组织和公开皮下脂肪组织，86529个细胞核来自不同分子亚型乳腺癌的癌相关脂肪组织，批次校正后批次效应得到有效去除，满足后续分析的质量要求。文献未提及具体实验产品，领域常规使用10x Genomics单细胞测序文库构建试剂、Illumina测序仪完成实验。
3.2 细胞聚类与注释分析
实验目的：解析正常乳腺脂肪和皮下脂肪的细胞组成，鉴定乳腺特异性脂肪细胞亚群。
方法细节：对测序数据进行质控过滤后，利用Seurat工具进行降维聚类，通过经典细胞类型标记基因注释细胞类群，随后对脂肪细胞谱系进行深入亚聚类，利用拟时序分析分析脂肪细胞的分化轨迹，利用单细胞调控网络推断分析转录调控网络，利用基因集富集分析解析不同亚群的生物学功能。
结果解读：经注释共得到7种主要基质细胞谱系：脂肪细胞、前脂肪细胞、内皮细胞、髓系细胞、淋巴细胞、周细胞和平滑肌细胞，对比显示正常乳腺脂肪中脂肪细胞比例显著高于皮下脂肪组织（p=0.049，n=6）。脂肪细胞谱系无监督聚类共得到9个转录水平异质的亚群，包括成熟脂肪细胞、过渡型脂肪细胞，以及7个前脂肪细胞亚群，其中2个亚群为皮下脂肪富集，5个为乳腺正常脂肪优势亚群，乳腺正常脂肪显著富集成熟脂肪细胞、Pre_Adi_FABP4和Pre_Adi_MMP16亚群，而皮下脂肪特异性亚群几乎不存在于乳腺脂肪中，证实了乳腺脂肪存在组织特异性的脂肪细胞亚群组成。
3.3 癌相关脂肪细胞亚群鉴定与功能分析
实验目的：对比正常脂肪和不同分子亚型乳腺癌癌相关脂肪的脂肪细胞亚群组成差异，鉴定肿瘤特异性脂肪细胞亚群并解析其功能。
方法细节：对9例癌相关脂肪组织的单核RNA测序数据进行相同流程的质控、聚类和注释，对比不同分组的亚群比例差异，利用拟时序分析分析亚群分化轨迹，利用转录调控分析和分泌组分析解析亚群功能，最后利用免疫荧光染色验证亚群的存在和临床相关性。
结果解读：对比分析显示，管腔型（雌激素受体阳性）乳腺癌癌旁脂肪中成熟脂肪细胞比例为21.8%，显著低于正常脂肪的85.0%（p<0.001，n=12），而低密度脂蛋白受体（LDLR）阳性成熟脂肪细胞（Adi_LDLR）亚群在雌激素受体阳性（30.5%）和三阴性乳腺癌（29.7%）癌旁脂肪中比例显著高于正常脂肪的2.8%（p<0.001，n=12）。免疫荧光验证显示，雌激素受体阳性癌相关脂肪中LDLR平均荧光强度显著高于正常脂肪（p=0.009，n=40），且复发患者癌旁脂肪区域LDLR信号强度显著高于无复发患者（p=0.031，n=20）。拟时序分析证实Adi_LDLR由成熟脂肪细胞转化而来，转录调控分析显示该亚群具有功能极化特征，一支调控细胞周期和细胞迁移，另一支调控脂质代谢，分泌组分析显示Adi_LDLR是促肿瘤因子的主要来源，细胞衰老和衰老相关分泌表型基因集在该亚群显著富集，证实该亚群具有促肿瘤和衰老失衡特征。
对于前脂肪细胞亚群，转化生长因子β受体1（TGFBR1）阳性前脂肪细胞（Pre_Adi_LGR4_TGFBR1）亚群在三阴性乳腺癌癌相关脂肪中占比18.1%，显著高于雌激素受体阳性乳腺癌的1.7%和正常脂肪的1.4%（p<0.001，n=12），免疫荧光验证显示三阴性乳腺癌癌相关脂肪中TGFBR1平均荧光强度显著高于雌激素受体阳性乳腺癌（p=0.034，n=40）和正常脂肪（p=0.011，n=40），且复发三阴性乳腺癌患者TGFBR1强度显著高于无复发患者（p=0.038，n=20）。功能分析显示该亚群脂肪酸代谢相关通路下调，丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B、Wnt、转化生长因子β等促肿瘤通路激活，且分泌更高水平的集落刺激因子1、血小板衍生生长因子C等促肿瘤因子，提示该亚群缺乏正常脂肪功能，可促进三阴性乳腺癌进展。此外，LDLR阳性前脂肪细胞（Pre_Adi_LDLR）亚群在雌激素受体阳性肿瘤癌旁脂肪中占比28.7%，显著高于正常脂肪（p<0.001，n=12），该亚群功能富集于程序性死亡配体1表达、程序性死亡蛋白1检查点通路、Th17细胞分化等通路，提示该亚群参与雌激素受体阳性乳腺癌免疫抑制微环境形成。实验所用关键产品：Servicebio的LEP抗体（货号GB11309）、CD34抗体（货号GB15013）、CST的CD68抗体（货号76 437S）、abclonal的IL-6抗体（货号A21264）。
3.4 脂肪细胞-巨噬细胞互作分析
实验目的：明确肿瘤特异性脂肪细胞亚群如何调控巨噬细胞功能，塑造免疫抑制微环境。
方法细节：对髓系细胞进行亚聚类注释，对比不同分组中巨噬细胞亚群的比例和功能差异，利用CellPhoneDB分析脂肪细胞与巨噬细胞之间的配体受体互作，最后利用癌症基因组图谱公共数据集验证亚群特征与免疫微环境的相关性。
结果解读：脂肪基质中髓系细胞是最主要的免疫成分，占比16.7%，仅次于脂肪细胞的42.4%，聚类共得到6个髓系细胞亚群，其中管腔型乳腺癌癌旁脂肪中周期相关巨噬细胞（Macro_Cycling）亚群比例显著升高（p<0.001，n=12），该亚群功能富集于免疫检查点激活通路和缺氧通路。对比正常脂肪和癌相关脂肪中的TREM2阳性巨噬细胞（Macro_TREM2），雌激素受体阳性乳腺癌癌相关脂肪中Macro_TREM2的细胞外基质相关通路上调，免疫调控通路下调；三阴性乳腺癌中Macro_TREM2同样呈现细胞外基质通路激活、抗原加工呈递等免疫通路下调的特征，提示该巨噬细胞亚群向促肿瘤表型极化。细胞互作分析显示，在雌激素受体阳性肿瘤中，Adi_LDLR是最主要的信号输出源，Macro_TREM2是信号输入强度最高的细胞类群，Adi_LDLR通过SPP1-整合素、VEGFA-NRP1、VEGFA-FLT1配体受体对与Macro_TREM2互作，这些互作已被证实参与免疫抑制、基质重塑和血管生成。癌症基因组图谱数据分析显示，基于Adi_LDLR特征的低风险组CD8+T细胞、活化自然杀伤细胞等细胞毒性免疫细胞浸润显著高于高风险组，高风险组上皮间质转化、细胞外基质受体相互作用通路显著富集。在三阴性乳腺癌中，Pre_Adi_LGR4_TGFBR1输出信号强度最高，主要通过LGALS3-MERTK、NGF-SORT1、FN1-整合素等配体受体对调控Macro_TREM2，这些互作同样具有促增殖、促转移和免疫抑制功能。癌症基因组图谱数据分析显示，基于该亚群特征的低风险组细胞毒性免疫细胞浸润更高，高风险组M2型巨噬细胞浸润更多，上皮间质转化通路富集，免疫应答通路下调。上述结果证实，肿瘤特异性（前体）脂肪细胞通过与巨噬细胞互作，形成了免疫抑制微环境促进肿瘤进展。该部分为生物信息学分析，未提及额外实验产品。
4. Biomarker 研究及发现成果
本研究鉴定得到的潜在生物标志物为肿瘤特异性脂肪细胞亚群标记物低密度脂蛋白受体（对应Adi_LDLR和Pre_Adi_LDLR亚群）和转化生长因子β受体1（对应Pre_Adi_LGR4_TGFBR1亚群），筛选验证逻辑完整：基于单核RNA测序差异表达分析筛选亚群特异性标记物→免疫组化、免疫荧光在大样本临床样本中验证标记物表达与肿瘤发生、复发的相关性→结合癌症基因组图谱公共数据集验证亚群特征与免疫微环境、预后的相关性。
上述生物标志物均来源于乳腺癌患者的癌旁脂肪组织，验证方法为免疫荧光定量检测标记物的平均荧光强度，结合临床随访数据分析标记物表达与复发的相关性。对于低密度脂蛋白受体，在雌激素受体阳性乳腺癌中，癌相关脂肪的低密度脂蛋白受体平均荧光强度显著高于正常脂肪（p=0.009，n=40），复发雌激素受体阳性患者癌旁脂肪低密度脂蛋白受体信号强度显著高于无复发患者（p=0.031，n=20），而肿瘤中心区域低密度脂蛋白受体信号显著低于癌旁区域（p<0.001，n=20），且无法预测复发（p=0.778，n=20），说明癌旁脂肪低密度脂蛋白受体可作为雌激素受体阳性乳腺癌复发的潜在预测标志物。Adi_LDLR和Pre_Adi_LDLR亚群特异性富集于雌激素受体阳性乳腺癌癌相关脂肪，功能上分别与细胞衰老、免疫抑制相关，通过与巨噬细胞互作促进免疫抑制微环境形成，基于Adi_LDLR特征的风险分层可有效区分雌激素受体阳性乳腺癌的免疫微环境状态。
对于转化生长因子β受体1，在三阴性乳腺癌中，癌相关脂肪转化生长因子β受体1平均荧光强度显著高于雌激素受体阳性乳腺癌（p=0.034，n=40）和正常脂肪（p=0.011，n=40），复发三阴性乳腺癌患者转化生长因子β受体1强度显著高于无复发患者（p=0.038，n=20），说明癌旁脂肪转化生长因子β受体1可作为三阴性乳腺癌复发的潜在预测标志物。Pre_Adi_LGR4_TGFBR1亚群特异性富集于三阴性乳腺癌癌相关脂肪，该亚群通过分泌促肿瘤因子、与巨噬细胞互作促进免疫抑制微环境形成，基于该亚群特征的风险分层可有效区分三阴性乳腺癌的免疫微环境状态和预后。
本研究的创新性在于首次在不同分子亚型乳腺癌中鉴定得到亚型特异性的脂肪细胞亚群生物标志物，明确了其与肿瘤复发的相关性，证实了这些生物标志物对应的脂肪细胞亚群通过调控巨噬细胞形成免疫抑制微环境，为乳腺癌的预后预测和间质靶向治疗提供了新的潜在靶点。本研究临床验证共纳入正常脂肪20例，雌激素受体阳性癌相关脂肪20例，三阴性乳腺癌癌相关脂肪20例，所有统计学结果均符合显著性标准，结论可靠性较高。