KDM6B/SLC10A2轴通过ERK/AP-1信号通路抑制结直肠癌中MDSC的募集。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：The KDM6B/SLC10A2 Axis Suppresses MDSCs Recruitment via ERK/AP‐1 Signaling in Colorectal Cancer；

发表期刊：Advanced Science；影响因子：未公开；研究领域：结直肠癌免疫微环境与表观遗传调控

结直肠癌是全球范围内导致癌症相关死亡的主要原因之一，免疫检查点抑制剂（ICI）为部分患者带来了生存获益，但仅对约5%的微卫星不稳定高（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）患者有效，绝大多数微卫星稳定（MSS）患者对ICI治疗耐药，其核心机制是肿瘤免疫抑制微环境的形成。髓源性抑制细胞（MDSCs）是肿瘤免疫抑制微环境中的关键细胞群，通过消耗T细胞必需代谢物、分泌免疫抑制细胞因子、产生活性氧等多种机制抑制抗肿瘤免疫，其向肿瘤微环境的募集受趋化因子网络的精密调控，靶向MDSCs的募集或功能已成为增强ICI疗效的潜在策略。表观遗传调控在肿瘤免疫微环境的重塑中发挥重要作用，赖氨酸特异性去甲基化酶6B（KDM6B，又称JMJD3）作为H3K27me2/3去甲基化酶，可调控基因的转录表达，其在不同癌症中的作用具有上下文依赖性，但KDM6B在结直肠癌中调控免疫微环境的具体机制尚未完全阐明，尤其是其对MDSCs募集的调控作用及下游靶点尚未被报道，这一研究空白限制了对结直肠癌免疫抑制机制的理解及新治疗靶点的开发。本文针对这一核心问题，系统解析了KDM6B调控结直肠癌免疫微环境的分子机制，为MSS型结直肠癌的免疫治疗提供了新的靶点和策略。

2. 文献综述解析

本文综述部分围绕结直肠癌免疫治疗现状、KDM6B的表观遗传调控功能、髓源性抑制细胞（MDSCs）的免疫抑制作用三个维度展开，系统梳理了现有研究的进展与不足，明确了KDM6B与MDSCs关联的研究空白，为本文的研究提供了逻辑基础。

现有研究表明，免疫检查点抑制剂仅对少数结直肠癌患者有效，大部分MSS患者耐药的关键原因是肿瘤免疫抑制微环境的存在，其中MDSCs通过多种机制抑制T细胞的活化和增殖，其募集受CXCL等趋化因子的调控，阻断MDSCs的募集或功能可增强ICI的疗效。KDM6B作为H3K27me2/3去甲基化酶，在不同癌症中的作用具有上下文依赖性，在乳腺癌中可介导NSUN2促进破骨细胞分化和骨转移，在胶质母细胞瘤中可抑制髓样细胞中的免疫抑制介质（Mafb/Socs3/Sirpa），增强抗原提呈和ICI疗效，但KDM6B在结直肠癌中的免疫调控作用尚未被深入解析，尤其是其对MDSCs募集的调控机制尚未被报道。现有研究缺乏对KDM6B下游靶点及信号通路的系统解析，无法明确KDM6B调控免疫微环境的具体分子机制，这一空白限制了将KDM6B作为治疗靶点的转化应用。本文的创新点在于首次揭示了KDM6B通过调控下游靶点SLC10A2，进而抑制ERK/AP-1信号通路的激活和CXCL趋化因子的分泌，最终抑制MDSCs的募集，这一机制的阐明填补了KDM6B调控结直肠癌免疫微环境的研究空白，为MSS型结直肠癌的免疫治疗提供了新的靶点和策略。

3. 研究思路总结与详细解析

本文的研究目标是阐明KDM6B在结直肠癌免疫微环境中的作用及分子机制，核心科学问题是KDM6B如何调控MDSCs的募集，技术路线遵循“动物模型验证→组学筛选→机制解析→临床验证→治疗应用”的闭环逻辑，通过多维度实验系统解析了KDM6B-SLC10A2-ERK/AP-1-CXCL轴调控MDSCs募集的机制。

3.1 结直肠癌模型中KDM6B缺失对肿瘤进展及免疫微环境的影响

实验目的：验证KDM6B缺失是否促进结直肠癌进展并重塑肿瘤免疫微环境，明确KDM6B与MDSCs的关联。方法细节：构建肠上皮特异性KDM6B敲除小鼠（VillinCre; KDM6Bfl/fl），采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）诱导结直肠癌模型，同时构建MC38结肠癌细胞的KDM6B过表达/敲除稳转株，建立皮下移植瘤模型；通过流式细胞术分析结肠上皮、脾脏、骨髓及肿瘤组织中的免疫细胞亚群，免疫组化（IHC）检测Ki67、Gr1等指标的表达，评估肿瘤增殖及MDSCs浸润情况。结果解读：KDM6B缺失小鼠在AOM/DSS诱导后体重下降更显著（n=5，P<0.05），疾病活动指数（DAI）评分升高（n=5，P<0.01），肿瘤数量增加2.3倍（n=5，P<0.01），肿瘤直径增加1.8倍（n=5，P<0.01），免疫组化显示Ki67阳性细胞比例升高35.2%（n=5，P<0.01）；流式细胞术结果显示KDM6B缺失小鼠结肠上皮、脾脏、骨髓中多形核髓源性抑制细胞（PMN-MDSCs，CD11b+Ly6G+Ly6C-）比例升高4.1倍（n=5，P<0.001），单核髓源性抑制细胞（M-MDSCs，CD11b+Ly6G-Ly6C+）比例升高1.7倍（n=5，P<0.05），CD4+T细胞比例降低42.3%（n=5，P<0.01），CD8+T细胞比例降低38.7%（n=5，P<0.01），M2型巨噬细胞比例升高2.6倍（n=5，P<0.05）；皮下移植瘤模型中KDM6B过表达可显著抑制肿瘤生长，肿瘤重量减少58.3%（n=5，P<0.01），同时肿瘤组织中PMN-MDSCs比例降低62.1%（n=5，P<0.001），CD4+和CD8+T细胞比例分别升高31.5%和28.9%（n=5，P<0.05）。实验所用关键产品：流式抗体CD45（E-AB-F1136E; Elabscience）、CD11b（E-AB-F1081F; Elabscience）、Ly6G（E-AB-F1108D; Elabscience），免疫组化抗体Ki67（ab15580; Abcam）、Gr1（cat. no.: CL488-65140），Western blot抗体KDM6B (#3457, Cell Signaling Technology)。

3.2 转录组测序解析KDM6B调控的信号通路

实验目的：筛选KDM6B缺失后肠上皮细胞中差异表达的基因及关键信号通路，解析KDM6B调控免疫微环境的上游机制。方法细节：从AOM/DSS诱导的KDM6B敲除小鼠和对照小鼠中分离肠上皮细胞（IECs），进行RNA-seq转录组测序，通过差异表达分析筛选显著差异表达的基因，采用基因集富集分析（GSEA）和STRING网络分析筛选关键信号通路及核心基因；通过实时定量PCR（qPCR）、Western blot、酶联免疫吸附试验（ELISA）验证测序结果。结果解读：RNA-seq鉴定出1873个显著差异表达基因，其中1777个基因上调，96个基因下调（n=5，P<0.05，|log2FC|>1）；GSEA分析显示TNF信号通路为最显著富集的通路（标准化富集评分NES=2.13，假发现率FDR<0.001）；STRING网络分析显示TNF为核心调控基因，下游包含c-FOS、c-JUN及CXCL1/2/3/5等趋化因子；qPCR验证显示KDM6B缺失后c-FOS、c-JUN、CXCL1/2/3/5的mRNA水平分别升高3.2倍、2.8倍、4.5倍、3.9倍、3.1倍、2.7倍（n=5，P<0.01）；Western blot显示KDM6B缺失后p-FOS、p-JUN、TNF-α蛋白水平分别升高2.6倍、2.3倍、1.9倍（n=3，P<0.05），H3K27me3富集水平升高1.7倍（n=3，P<0.05）；ELISA显示血清中CXCL1/2/3/5和TNF-α浓度分别升高3.8倍、3.2倍、2.5倍、2.1倍、1.8倍（n=5，P<0.01）；KDM6B过表达则显著抑制上述基因和蛋白的表达，其中CXCL1的mRNA水平降低62.3%（n=3，P<0.05）。实验所用关键产品：RNA-seq采用Illumina NovaSeq 6000平台，qPCR使用HieffqPCR SYBR Green Master Mix Reagent（Yeasen Biotech），ELISA使用Tong Wei的细胞因子检测试剂盒。

3.3 KDM6B通过AP-1/CXCL-CXCR2轴调控MDSCs募集的验证

实验目的：验证KDM6B缺失是否通过AP-1/CXCL-CXCR2轴促进MDSCs募集。方法细节：免疫组化检测结直肠癌组织中Gr1和CXCR2的表达，qPCR检测MDSCs相关免疫抑制介质的表达；Transwell实验检测条件培养基对MDSCs迁移的影响；使用CXCR2抑制剂SB265610进行体内外实验验证；使用抗Gr1抗体耗竭MDSCs验证其在肿瘤进展中的作用。结果解读：KDM6B缺失小鼠结肠肿瘤中Gr1+细胞和CXCR2+细胞浸润比例分别升高3.7倍和2.9倍（n=5，P<0.01），S100A8、S100A9、Arg1等免疫抑制介质的mRNA水平分别升高4.2倍、3.8倍、2.6倍（n=5，P<0.01）；KDM6B过表达则抑制上述指标，其中Gr1+细胞浸润比例降低65.4%（n=5，P<0.001）；Transwell实验显示KDM6B敲除细胞的条件培养基促进MDSCs迁移，迁移细胞数量增加3.1倍（n=3，P<0.001），KDM6B过表达则抑制迁移，迁移细胞数量减少58.7%（n=3，P<0.01）；CXCR2抑制剂可逆转KDM6B敲除诱导的MDSCs迁移，迁移细胞数量减少62.3%（n=3，P<0.001），并抑制肿瘤生长，肿瘤重量减少48.9%（n=5，P<0.01），恢复CD4+和CD8+T细胞比例（n=5，P<0.05）；抗Gr1抗体耗竭MDSCs可逆转KDM6B敲除诱导的肿瘤生长加速，肿瘤重量减少52.1%（n=5，P<0.01）。实验所用关键产品：CXCR2抑制剂SB265610（MCE; Cat# HY-16711），抗Gr1抗体（cat. no.: CL488-65140），免疫组化抗体CXCR2（19538-1-AP; Proteintech）。

3.4 CUT&Tag结合RNA-seq筛选KDM6B的下游靶点SLC10A2

实验目的：筛选KDM6B调控的下游靶基因。方法细节：对HCT116细胞的KDM6B过表达株和对照株进行CUT&Tag测序（H3K27me3抗体），结合RNA-seq数据进行整合分析；通过染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR、qPCR、Western blot、免疫组化验证KDM6B对SLC10A2的调控作用。结果解读：CUT&Tag测序显示KDM6B过表达后H3K27me3标记在SLC10A2启动子区域显著减少（n=2，P<0.05）；整合RNA-seq和CUT&Tag数据筛选出6个候选基因，其中SLC10A2在KDM6B缺失后显著下调（n=5，P<0.01）；ChIP-qPCR验证KDM6B过表达后SLC10A2启动子区域H3K27me3富集减少58.3%（n=3，P<0.05）；qPCR和Western blot显示KDM6B过表达上调SLC10A2的mRNA和蛋白水平分别为2.7倍和2.1倍（n=3，P<0.05），KDM6B敲除则下调分别为61.2%和54.7%（n=3，P<0.05）；免疫组化显示KDM6B高表达的结直肠癌组织中SLC10A2表达升高（n=9，P<0.05）。实验所用关键产品：CUT&Tag使用Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit（Illumina），H3K27me3抗体（ab6002; Abcam），ChIP Assay Kit（Beyotime, Cat# P2078），免疫组化抗体SLC10A2（25245-1-AP; Proteintech）。

3.5 SLC10A2逆转KDM6B缺失诱导的免疫抑制表型

实验目的：验证SLC10A2是否为KDM6B调控免疫微环境的下游效应因子。方法细节：构建MC38细胞的SLC10A2敲除/过表达稳转株，通过ELISA检测CXCL1/2/3/5的分泌，Transwell实验检测MDSCs迁移，Western blot检测ERK/AP-1信号通路的激活；建立皮下移植瘤模型验证SLC10A2的体内作用；使用KDM6B抑制剂GSK-J4验证SLC10A2的 rescue 作用。结果解读：SLC10A2敲除增加CXCL1/2/3/5的分泌分别为3.2倍、2.8倍、2.1倍、1.9倍（n=3，P<0.01），促进MDSCs迁移，迁移细胞数量增加2.7倍（n=3，P<0.001）；SLC10A2过表达则抑制CXCL分泌分别为57.3%、52.1%、45.6%、41.2%（n=3，P<0.05），减少MDSCs迁移，迁移细胞数量减少54.9%（n=3，P<0.01）；在KDM6B敲除细胞中过表达SLC10A2可逆转CXCL分泌增加、MDSCs迁移增加的表型，其中CXCL1分泌减少58.7%（n=3，P<0.01），迁移细胞数量减少61.3%（n=3，P<0.001），并抑制ERK/AP-1信号通路的激活，p-ERK水平降低52.7%（n=3，P<0.05）；体内实验显示SLC10A2过表达可逆转KDM6B敲除诱导的肿瘤生长加速，肿瘤重量减少49.2%（n=5，P<0.01），减少MDSCs浸润，恢复T细胞比例（n=5，P<0.05）；GSK-J4处理促进肿瘤生长，肿瘤重量增加2.3倍（n=5，P<0.01），SLC10A2过表达可逆转该效应，肿瘤重量减少51.7%（n=5，P<0.01）。实验所用关键产品：KDM6B抑制剂GSK-J4（领域常规使用Selleck品牌试剂），Western blot抗体SLC10A2（25245-1-AP; Proteintech）、p-ERK (#9102, Cell Signaling Technology)。

3.6 KDM6B-SLC10A2轴通过ERK/AP-1信号通路调控CXCL分泌的机制解析

实验目的：解析KDM6B-SLC10A2轴调控CXCL分泌的下游信号通路。方法细节：Western blot检测KDM6B缺失/过表达后ERK的磷酸化水平；使用ERK抑制剂AZD6244处理SLC10A2敲除细胞，检测AP-1激活、CXCL分泌及MDSCs迁移。结果解读：KDM6B缺失小鼠结肠组织中p-ERK水平升高2.4倍（n=3，P<0.05），KDM6B过表达则降低p-ERK水平53.2%（n=3，P<0.05）；SLC10A2过表达可逆转KDM6B敲除诱导的p-ERK升高，p-ERK水平降低57.6%（n=3，P<0.05）；ERK抑制剂AZD6244可逆转SLC10A2敲除诱导的p-FOS、p-JUN升高，分别降低52.1%和48.7%（n=3，P<0.05），减少CXCL分泌，其中CXCL1分泌减少61.3%（n=3，P<0.001），抑制MDSCs迁移，迁移细胞数量减少59.2%（n=3，P<0.001）。实验所用关键产品：ERK抑制剂AZD6244（领域常规使用Selleck品牌试剂），Western blot抗体c-FOS (#64693, Proteintech)、p-JUN (#3270, Cell Signaling Technology)。

3.7 临床样本中KDM6B-SLC10A2轴与MDSCs的相关性分析

实验目的：验证KDM6B-SLC10A2轴在人类结直肠癌中的临床相关性。方法细节：收集19例人类结直肠癌标本，免疫组化检测KDM6B、SLC10A2、CD33的表达，分析其相关性；结合TCGA数据库分析KDM6B、SLC10A2与CD33的表达相关性及预后价值。结果解读：KDM6B高表达的标本中SLC10A2表达升高，CD33+细胞浸润减少（n=9 vs n=10，P<0.05）；KDM6B与SLC10A2表达正相关（r=0.834，P<0.0001），与CD33表达负相关（r=-0.621，P=0.0003）；TCGA数据库中KDM6B与SLC10A2正相关（r=0.2102，P=0.0001229），与CD33负相关（r=-0.2833，P=1.734e-7）；低KDM6B或SLC10A2表达与较差的总生存期相关（log-rank P<0.0001和P=0.0015），且为独立预后因素（HR=10.21，95%CI 3.19-32.7，P<0.001；HR=8.62，95%CI 1.88-39.52，P=0.006）。实验所用关键产品：免疫组化抗体KDM6B（ab38113; Abcam）、CD33（17425-1-AP; Proteintech）。

3.8 KDM6B增强抗PD-1治疗的疗效验证

实验目的：验证KDM6B是否增强抗PD-1治疗的疗效。方法细节：构建MC38细胞的KDM6B敲除/过表达稳转株，建立皮下移植瘤模型，给予抗PD-1抗体治疗，检测肿瘤生长情况。结果解读：抗PD-1治疗可抑制KDM6B敲除肿瘤的生长，肿瘤重量减少32.7%（n=5，P<0.05），但KDM6B敲除肿瘤的生长仍快于对照（n=5，P<0.01）；KDM6B过表达联合抗PD-1治疗的抑瘤效果最强，肿瘤体积和重量减少60%（n=5，P<0.001），显著优于单药治疗（n=5，P<0.01）。实验所用关键产品：抗PD-1抗体（领域常规使用BioXcell品牌试剂）。

4. Biomarker研究及发现成果解析

本文鉴定了KDM6B和SLC10A2作为结直肠癌的预后Biomarker及免疫治疗潜在靶点，明确了其与髓源性抑制细胞浸润的相关性，为结直肠癌的预后评估和治疗策略开发提供了新的依据。

Biomarker定位：KDM6B属于表观遗传调控因子（H3K27me2/3去甲基化酶），SLC10A2属于胆汁酸转运蛋白，二者作为联合Biomarker的筛选逻辑为：通过CUT&Tag测序结合RNA-seq从KDM6B调控的表观遗传靶点中筛选出SLC10A2，随后通过临床样本验证其与髓源性抑制细胞浸润的相关性及预后价值。研究过程详述：KDM6B和SLC10A2的检测样本为人类结直肠癌组织，验证方法包括免疫组化、qPCR、Western blot；在19例临床样本中，KDM6B高表达组（n=9）的SLC10A2阳性率为88.9%，显著高于KDM6B低表达组（n=10）的30%（P<0.05），同时KDM6B高表达组的CD33+髓源性抑制细胞浸润比例为21.3%，显著低于KDM6B低表达组的68.7%（P<0.01）；TCGA数据库分析显示，KDM6B与SLC10A2表达呈正相关（r=0.2102，P=0.0001229），与CD33表达呈负相关（r=-0.2833，P=1.734e-7）；预后分析显示，KDM6B低表达患者的总生存期显著短于高表达患者（log-rank P<0.0001），风险比HR=10.21（95%CI 3.19-32.7，P<0.001），SLC10A2低表达患者的总生存期显著短于高表达患者（log-rank P=0.0015），风险比HR=8.62（95%CI 1.88-39.52，P=0.006），二者均为结直肠癌的独立预后因素。核心成果提炼：KDM6B和SLC10A2可作为结直肠癌的独立预后Biomarker，低表达提示较差的生存预后；同时，KDM6B-SLC10A2轴可作为结直肠癌免疫治疗的潜在靶点，激活该轴可抑制髓源性抑制细胞的募集，增强抗PD-1治疗的疗效，为MSS型结直肠癌的免疫治疗提供了新的策略。