FBXW7 靶向 SPT6-α”Np63 轴进行降解，从而抑制 4-硝基喹啉 N-氧化物诱导的食管肿瘤发生。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：FBXW7 Targets the SPT6‐ΔNp63 Axis for Degradation to Inhibit Esophageal Tumorigenesis Induced by 4‐Nitroquinoline N‐Oxide；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤学，食管鳞状细胞癌发病机制。

领域共识：食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的第七大原因，中国食管癌病例中约90%为食管鳞状细胞癌（ESCC）。近年多组学研究已经将ESCC分为不同分子亚型，全基因组测序明确了ESCC的突变谱，FBXW7是ESCC中高频突变的基因之一。FBXW7是经典的抑癌基因，作为Cullin-RING连接酶1（CRL1）的关键底物受体，可通过泛素化降解多种癌蛋白如c-MYC、NOTCH1等，发挥抑制肿瘤细胞生长的功能。然而，此前关于FBXW7的研究多集中在其他组织肿瘤，FBXW7在食管组织中的特异性生理功能及其对食管肿瘤发生的调控作用尚未明确。

SPT6是与RNA聚合酶II结合的组蛋白伴侣，可促进转录延伸、维持染色质结构，现有研究发现SPT6可促进结直肠癌、胶质母细胞瘤的进展，还可调控表皮细胞中p63的转录维持细胞命运，但SPT6在ESCC中的功能尚未明确，且其稳定性是否受泛素-蛋白酶体系统调控也未见报道。p63的ΔNp63亚型是食管鳞状组织中主要表达的致癌亚型，虽然已有研究报道FBXW7可降解p63，但FBXW7是否在ESCC中靶向调控ΔNp63仍不清楚。当前领域存在的核心研究空白为：缺乏食管上皮特异性FBXW7敲除的生理模型明确FBXW7在ESCC发生中的因果作用，FBXW7调控ESCC的新下游底物及分子机制未被系统阐明，本研究针对这一问题展开，明确了FBXW7抑癌功能的新机制，为ESCC的预后判断和靶向治疗提供了新的方向。

2. 文献综述解析

作者对现有研究的梳理围绕FBXW7、SPT6、ΔNp63三个核心分子展开，按分子功能和研究进展逐步梳理现有研究的结论与局限性。首先关于FBXW7，现有研究已经明确其作为抑癌基因在多种肿瘤中发挥功能，发现FBXW7通过降解癌蛋白抑制肿瘤发生，还存在非降解依赖的功能如调控DNA修复，FBXW7失活突变在多种肿瘤中高频出现，可导致癌蛋白积累促进肿瘤进展，但此前没有研究利用食管上皮特异性敲除小鼠模型，明确FBXW7在生理条件下对食管肿瘤发生的作用，其在ESCC中的功能一直存在争议。

关于SPT6，现有研究已经明确其作为转录延伸因子和组蛋白伴侣的基本生物学功能，发现其在结直肠癌、胶质母细胞瘤中发挥促癌作用，还发现SPT6缺失可导致表皮细胞中p63转录停滞，影响细胞命运决定，但SPT6在ESCC中的功能完全未被探索，且SPT6本身的稳定性调控机制，尤其是是否被E3泛素连接酶靶向降解，此前没有相关报道。关于ΔNp63，现有研究已经明确两个p63亚型的功能分化，ΔNp63作为致癌基因在鳞状细胞癌中发挥功能，已经发现多个E3泛素连接酶可调控ΔNp63的稳定性，其中包括FBXW7，但该调控关系未在ESCC中得到验证，其在ESCC发生中的作用也不明确。

现有研究的局限性主要包括三点：一是缺乏体内生理模型明确FBXW7在食管肿瘤发生中的因果作用，二是FBXW7在ESCC中的未知下游底物未被系统筛选，三是SPT6在ESCC中的功能和调控机制完全未阐明。本研究的创新价值在于，首次通过基因修饰小鼠模型明确了FBXW7在4NQO诱导ESCC中的抑癌功能，首次鉴定SPT6是FBXW7的全新底物，阐明了FBXW7-SPT6-ΔNp63轴调控ESCC发生的完整分子机制，为ESCC的临床预后和靶向治疗提供了新的潜在靶点，填补了领域研究空白。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标为明确FBXW7在ESCC发生中的作用及分子机制，核心科学问题是FBXW7通过什么下游底物调控ESCC的发生发展，技术路线遵循从临床突变分析→体内功能验证→底物筛选→生化机制验证→下游效应验证→临床相关性验证的完整逻辑闭环。

3.1 FBXW7在人ESCC中的突变特征分析

实验目的：明确FBXW7在人ESCC中的遗传改变特征，初步探索其与ESCC发生的关联。方法细节：利用cBioPortal数据库整合的基因组数据，分析227例ESCC样本中FBXW7的遗传改变，进一步利用COSMIC数据库验证FBXW7突变的分布特征。结果解读：分析结果显示约4%的ESCC样本存在FBXW7的遗传改变，大部分改变为点突变，突变热点集中在FBXW7的WD40底物结合域，包括S462F、R465C、R505C/G等，这些突变也在其他人类肿瘤中被报道，提示FBXW7突变失活可能参与ESCC的发生发展。产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用生物信息学数据库分析工具。

3.2 体内动物模型构建与FBXW7功能验证

实验目的：在体内生理条件下明确FBXW7缺失对食管肿瘤发生的影响。方法细节：通过杂交构建两种基因修饰小鼠模型，分别为食管上皮特异性Pik3ca活化单突变小鼠、Fbxw7敲除联合Pik3ca活化双突变小鼠，正常饲养1年后观察食管肿瘤发生情况；另外构建食管上皮特异性Fbxw7敲除小鼠和野生型对照小鼠，采用致癌物4-硝基喹啉N-氧化物（4NQO）饮水诱导ESCC，分为短期处理（8周4NQO+16周清水）和长期处理（16周4NQO+8周清水），处理结束后处死小鼠，对食管组织进行大体观察、苏木精-伊红染色和Ki67免疫组化（IHC）染色，统计肿瘤数量和病理分型。结果解读：正常饲养1年后，单突变和双突变小鼠的食管均未出现明显病理改变，无肿瘤形成，提示Pik3ca E545K活化单独或联合Fbxw7敲除都不足以自发诱导食管肿瘤发生；长期4NQO处理后，Fbxw7敲除小鼠食管肿瘤数量显著高于野生型对照（野生型n=18，Fbxw7敲除n=22，P<0.001），肿瘤体积更大，病理分析显示Fbxw7敲除小鼠中原位癌比例为81.8%，显著高于野生型的44.4%（P=0.014），Ki67阳性增殖细胞比例也显著高于野生型（n=5，P<0.001），明确Fbxw7是抑癌基因，其缺失可加速4NQO诱导的食管鳞状细胞癌发生。产品关联：实验所用关键产品：4-硝基喹啉-1-oxide（Sigma-Aldrich，N8141）。

3.3 FBXW7新底物的筛选与验证

实验目的：筛选并验证Fbxw7敲除后积累的FBXW7潜在底物。方法细节：收集4对野生型和Fbxw7敲除小鼠的ESCC肿瘤组织，进行全蛋白质组质谱分析，筛选差异表达蛋白（筛选标准为倍数变化>1.5，P<0.05），随后在上调蛋白中筛选含有保守Cdc4磷酸降解基序（CPD，FBXW7结合的必需基序）的候选分子，结合TCGA和GTEx数据库分析候选基因在ESCC中的表达，得到候选分子后，在人ESCC细胞系中通过CRL连接酶抑制剂MLN4924处理、FBXW7敲低和过表达，检测候选分子的蛋白水平变化，最后在小鼠ESCC组织中通过免疫印迹和免疫组化验证SPT6的表达差异。结果解读：质谱筛选共得到55个Fbxw7敲除后上调的蛋白，经过生物信息学筛选得到8个符合条件的候选，生化验证显示只有SPT6在MLN4924处理后呈剂量依赖性积累，FBXW7敲低后SPT6蛋白水平显著升高（n=3，P<0.01），FBXW7过表达后SPT6水平呈剂量依赖性降低（n=3，P<0.05），小鼠Fbxw7敲除ESCC组织中SPT6阳性染色比例显著高于野生型（n=5，P<0.01），确定SPT6是FBXW7的候选底物。产品关联：实验所用关键产品：MLN4924（ApexBio，B1036），SPT6抗体（Santa Cruz，sc-393920、Novus，NB100-2582）。

3.4 FBXW7与SPT6的相互作用验证

实验目的：明确FBXW7与SPT6的分子结合机制。方法细节：在ESCC细胞中分别进行内源性和外源性的免疫共沉淀实验，验证两者的相互作用，分别构建FBXW7和SPT6的截短突变体，明确两者的结合区域，对SPT6的CPD基序的磷酸化位点进行点突变，验证磷酸化修饰对FBXW7结合的必要性，进一步检测肿瘤来源的FBXW7热点突变体与SPT6的结合能力，最后通过免疫荧光染色验证两者的亚细胞共定位。结果解读：内源性免疫共沉淀明确生理条件下FBXW7和SPT6可以发生直接相互作用，FBXW7通过WD40底物结合域结合SPT6，SPT6通过1143-1147位的保守CPD基序（SPNTE）结合FBXW7，CPD基序磷酸化位点突变后，FBXW7与SPT6的结合能力显著下降，肿瘤来源的FBXW7突变体R465H和R479Q与SPT6的结合能力也显著降低，免疫荧光染色显示两者共定位于细胞核，明确了两者的分子结合机制。产品关联：文献未提及特殊实验产品，领域常规使用免疫共沉淀试剂、荧光显微镜。

3.5 FBXW7促进SPT6泛素化降解的机制验证

实验目的：明确FBXW7调控SPT6稳定性的分子机制。方法细节：采用体内泛素化实验检测FBXW7对SPT6的泛素化修饰，放线菌酮追踪实验检测不同FBXW7表达水平下SPT6的蛋白半衰期，进一步验证糖原合成酶激酶3β（GSK3β）对SPT6的磷酸化作用，以及GSK3β对FBXW7介导SPT6降解的影响。结果解读：FBXW7敲低可抑制SPT6的多聚泛素化修饰，FBXW7过表达可增强野生型SPT6而非CPD突变型SPT6的多聚泛素化，FBXW7的连接酶失活突变体ΔF失去促进SPT6泛素化的能力；半衰期实验显示，在KYSE150细胞中，FBXW7敲低后SPT6半衰期从8.4小时延长到46.4小时，FBXW7过表达后SPT6半衰期从9.4小时缩短到5.1小时，失活突变体则延长SPT6半衰期；进一步验证发现GSK3β负责磷酸化SPT6的CPD基序，GSK3β抑制剂处理或敲低GSK3β可抑制FBXW7与SPT6的结合，延长SPT6半衰期，抑制SPT6的泛素化修饰，明确GSK3β-FBXW7轴作为激酶-E3连接酶配对，促进SPT6的泛素化和蛋白酶体降解。产品关联：实验所用关键产品：放线菌酮（MedChem Express，HY‐12320），MG132（MedChem Express，HY‐13259）。

3.6 SPT6的促癌功能验证

实验目的：明确SPT6在ESCC细胞中的生物学功能，以及SPT6是否介导FBXW7的抑癌作用。方法细节：在ESCC细胞中分别敲低SPT6和FBXW7，进行CCK8细胞增殖实验和克隆形成实验，流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡比例，随后进行回复实验，同时敲低FBXW7和SPT6，检测细胞增殖和克隆形成能力的变化。结果解读：SPT6敲低显著抑制ESCC细胞增殖（n=3，P<0.01）和克隆形成能力（n=3，P<0.001），诱导G2/M期细胞周期阻滞（n=3，P<0.05）和细胞凋亡（n=3，P<0.01），FBXW7敲低则促进细胞增殖和克隆形成，回复实验显示同时敲低SPT6可以显著逆转FBXW7敲低的促生长作用（n=3，P<0.001），明确SPT6是ESCC的促癌因子，其积累是FBXW7缺失促进ESCC进展的关键原因。产品关联：实验所用关键产品：Cell Counting Kit‐8（MedChem Express）。

3.7 下游ΔNp63的调控验证

实验目的：明确SPT6和FBXW7对下游效应分子ΔNp63的调控机制。方法细节：在ESCC细胞中敲低或过表达SPT6，分别检测ΔNp63的mRNA和蛋白水平，染色质免疫共沉淀验证SPT6是否直接结合ΔNp63的启动子区域；随后验证FBXW7对ΔNp63的泛素化降解作用，最后进行功能回复实验验证ΔNp63的功能。结果解读：SPT6敲低可降低ΔNp63的mRNA和蛋白水平，过表达SPT6则剂量依赖性升高ΔNp63的表达水平，染色质免疫共沉淀验证SPT6直接结合ΔNp63的启动子区域（n=3，P<0.05），说明SPT6在转录水平上调ΔNp63；FBXW7可直接结合ΔNp63，FBXW7敲低促进ΔNp63蛋白积累，延长其蛋白半衰期，FBXW7过表达促进ΔNp63的泛素化降解；ΔNp63敲低可抑制ESCC细胞增殖和克隆形成，还可以逆转FBXW7敲低的促生长作用（n=3，P<0.001），明确ΔNp63是FBXW7-SPT6轴的下游效应分子，SPT6在转录水平上调ΔNp63，FBXW7在翻译后水平通过靶向降解负调控ΔNp63。产品关联：实验所用关键产品：SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit（Cell Signaling Technology，9003），ΔNp63抗体（Abcam，ab203826）。

3.8 体内功能验证与临床样本相关性分析

实验目的：在体内异种移植瘤模型验证FBXW7-SPT6轴的功能，在临床样本中验证该轴的临床相关性和预后价值。方法细节：构建稳定敲低FBXW7、SPT6以及同时敲低两者的KYSE150细胞，接种到裸鼠皮下建立异种移植瘤模型，定期测量肿瘤体积，实验结束后测量肿瘤重量，免疫组化检测肿瘤组织中各蛋白的表达；随后对包含86例人ESCC样本的组织芯片进行FBXW7和SPT6免疫组化染色，分析两者表达的相关性，结合随访资料进行Kaplan-Meier生存分析。结果解读：体内实验显示，FBXW7敲低促进异种移植瘤生长，SPT6敲低抑制肿瘤生长，同时敲低两者可分别逆转单敲低的效果（肿瘤体积n=3，肿瘤重量n=6，P<0.05），肿瘤组织中FBXW7水平与SPT6、ΔNp63水平负相关，SPT6与ΔNp63水平正相关；临床样本分析显示，86例人ESCC样本中FBXW7与SPT6蛋白水平呈显著负相关（r=-0.5036，P<0.001），在51例有完整随访资料的样本中，高FBXW7低SPT6组（n=26）患者总体生存期显著优于低FBXW7高SPT6组（n=25），log-rank检验P<0.01，低FBXW7高SPT6与ESCC不良预后相关。产品关联：文献未提及特殊实验产品，领域常规使用肿瘤组织芯片、免疫组化试剂。

4. Biomarker研究及发现成果

Biomarker定位：本研究鉴定FBXW7-SPT6表达轴作为ESCC预后预测的生物标志物，其中FBXW7为抑癌标志物，SPT6为致癌标志物，筛选验证逻辑完整，依次为：基因修饰小鼠模型结合全蛋白质组筛选获得候选分子→细胞水平生化验证调控关系→体内异种移植瘤模型验证功能→临床ESCC组织芯片验证表达相关性和预后价值。

研究过程详述：该标志物的表达数据来源于86例人ESCC临床肿瘤组织样本，采用免疫组化染色检测FBXW7和SPT6的蛋白表达水平，通过Pearson相关分析分析两者的表达相关性，结合临床随访资料，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验分析不同表达分组的生存差异。统计结果显示，FBXW7与SPT6的蛋白表达在ESCC组织中呈显著负相关（r=-0.5036，n=86，P<0.001），进一步亚组分析显示，III-IV期ESCC样本中SPT6阳性染色比例显著高于I-II期样本，合并淋巴结转移的ESCC样本中SPT6表达水平显著高于无淋巴结转移样本，FBXW7则呈现相反的表达趋势；生存分析显示，在51例有完整随访资料的ESCC患者中，低FBXW7表达联合高SPT6表达（n=25）与不良总体预后显著相关，高FBXW7表达联合低SPT6表达（n=26）患者的预后更好，log-rank检验P<0.01。

核心成果提炼：本研究首次在ESCC中明确了FBXW7-SPT6-ΔNp63轴的调控机制，FBXW7-SPT6轴可作为ESCC预后预测的生物标志物，低FBXW7高SPT6的表达模式与ESCC更高的临床分期、淋巴结转移和不良预后显著相关（n=51，P<0.01），该研究的创新性在于首次鉴定SPT6是FBXW7的全新底物，首次阐明该轴在ESCC发生中的调控功能，为ESCC的预后判断提供了新的标志物，同时也为ESCC的靶向治疗提供了新的潜在靶点。