一种创新的工程化IL-10单体通过抗PD-1顺式递送增强T细胞介导的抗肿瘤反应。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：An innovative engineered IL-10 monomer strengthens T cell-mediated anti-tumor responses through anti-PD-1cis-delivery；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤免疫治疗，免疫检查点抑制剂联合细胞因子药物开发。

领域共识：以抗PD-1抗体为代表的免疫检查点阻断疗法是当前晚期实体肿瘤的核心治疗方案，但其临床应用仍受限于完全缓解率低、易产生耐药性等问题。PD-1耐药的核心机制之一是肿瘤微环境中持续存在对PD-1阻断不敏感的终末耗竭CD8+T细胞。为克服耐药，第二代PD-1治疗药物包括细胞因子融合蛋白、双特异性抗体等方向快速发展，其中抗PD-1与细胞因子的融合是当前研究热点，已有的抗PD-1×IL-2等方案展现出优于传统单抗的疗效，但仍存在细胞因子相关毒性问题。

白介素-10（IL-10）是一类多效性细胞因子，可特异性激活耗竭CD8+T细胞恢复其效应功能，在肿瘤免疫治疗中具备较大应用潜力。前期开发的聚乙二醇化IL-10（AM0010）在Ⅰ期临床中联合PD-1抑制剂展现出一定疗效，但严重的血液学毒性（重度贫血、血小板减少）限制了给药剂量，最终在Ⅱ、Ⅲ期临床未取得显著获益。当前主流解决策略是利用抗体将IL-10靶向递送至肿瘤微环境以降低全身毒性，但融合蛋白中保留的天然二聚体IL-10仍保留较强的外周活性，高剂量下仍存在外周毒性风险。因此，开发新型结构改造的IL-10融合药物，在保留抗肿瘤活性的同时降低血液学毒性，是该领域亟待解决的核心问题。本研究针对该问题开发了抗PD-1偶联工程化IL-10单体的融合蛋白，为解决PD-1耐药和IL-10临床毒性问题提供了新的技术方案。

2. 文献综述解析

作者围绕抗PD-1联合IL-10抗肿瘤治疗的发展现状与毒性问题展开综述，按技术发展路径梳理了现有研究的成果与局限性。首先梳理第二代抗PD-1治疗的整体发展，现有研究证实包括抗PD-1×IL-2、抗-PD-1×IL-12等细胞因子融合蛋白以及双特异性抗体在内的第二代药物，抗肿瘤效果优于传统抗PD-1单抗，具备成为下一代主流临床方案的潜力，其中抗PD-1联合IL-2的方案已经进入临床并取得不错疗效，但IL-2会诱导激活诱导性细胞死亡，促进T细胞耗竭，且对终末耗竭CD8+T细胞无作用，无法解决PD-1耐药的核心问题。

接着梳理IL-10相关抗肿瘤药物的研究进展，现有研究已经证实IL-10可直接激活耗竭CD8+T细胞，增强其增殖和效应功能，联合免疫检查点阻断可在小鼠模型中实现实体瘤完全消退。聚乙二醇化IL-10 AM0010在Ⅰ期临床中联合PD-1抑制剂治疗转移性肾细胞癌的客观缓解率达到41%，非小细胞肺癌达到43%，证实了IL-10的临床潜力，但IL-10相关的血液学毒性限制了AM0010的给药剂量不超过20μg/kg，多数患者因毒性减药或停药，最终Ⅱ、Ⅲ期临床未取得显著获益，其毒性瓶颈成为限制IL-10临床应用的核心障碍。

随后梳理当前解决IL-10毒性的策略，现有策略包括CAR-T分泌IL-10、抗体靶向IL-10融合蛋白，通过将IL-10靶向递送至肿瘤降低全身活性，其中抗体靶向递送是当前主流方案，可延长半衰期且不增加毒性，在小鼠模型中展现出优于非靶向IL-10的活性，但融合蛋白中保留的天然二聚体IL-10仍保留较强活性，临床应用尤其是高剂量下仍存在外周毒性风险，现有技术方案仍需进一步优化。

作者明确本研究的创新点在于，首次将结构改造后活性降低的IL-10单体与抗PD-1抗体融合，通过抗PD-1的顺式靶向富集作用，在降低IL-10全身毒性的同时保留其对肿瘤浸润耗竭CD8+T细胞的激活活性，解决了现有IL-10药物毒性大的核心问题，填补了该方向的研究空白。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的研究目标是开发可克服IL-10血液学毒性、同时逆转CD8+T细胞耗竭增强抗PD-1疗效的新型融合蛋白，核心科学问题是工程化改造的IL-10单体联合抗PD-1顺式递送能否在降低毒性的同时保留抗肿瘤活性，技术路线为：验证野生型IL-10毒性机制→工程化改造获得IL-10单体→设计构建抗PD-1×IL-10M融合蛋白→体外验证顺式结合增强活性的机制→体内验证抗肿瘤疗效→非人灵长类验证安全性，形成了从机制到药物开发的完整闭环。

3.1 野生型IL-10抗肿瘤活性与毒性机制验证

实验目的：验证野生型IL-10与抗PD-1的协同抗肿瘤作用，并明确IL-10介导血液学毒性的核心机制。方法细节：采用CT26荷瘤PD-1人源化小鼠模型，分为野生型IL-10-Fc单药组、抗PD-1单药组、联合给药组，腹腔注射给药后监测肿瘤体积（n=7/组）；分离人外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测野生型IL-10-Fc与不同免疫细胞亚群的结合活性；分离外周血单核细胞经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导为巨噬细胞，检测巨噬细胞吞噬IgG预处理红细胞的能力。结果解读：肿瘤生长曲线结果显示，野生型IL-10-Fc和抗PD-1单药抗肿瘤效果相当，联合给药的肿瘤生长抑制效果更显著（P<0.0001，n=7），证实两者存在协同作用；结合实验结果显示野生型IL-10-Fc对CD14+单核细胞的结合水平显著高于其他免疫细胞亚群（P<0.0001，n=3）；野生型IL-10-Fc可显著上调巨噬细胞表面吞噬标志物CD16和CD163（P<0.01，n=2），且呈浓度依赖性促进巨噬细胞对红细胞的吞噬（P<0.01，n=3），证实野生型IL-10促进巨噬细胞吞噬红细胞是其血液学毒性的潜在机制。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用流式检测抗体、细胞培养试剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等。

3.2 工程化IL-10单体的活性与毒性验证

实验目的：验证工程化改造后IL-10单体（IL-10M）的活性降低效果，明确其降低毒性的潜力。方法细节：在野生型IL-10的Asn116和Lys117之间插入6个氨基酸（GGGSGG）构建IL-10M；分离人外周血单个核细胞，检测不同浓度野生型IL-10-Fc和IL-10M-Fc对肿瘤坏死因子-α分泌的抑制能力；分离单核细胞，检测两种分子介导的信号转导与转录激活因子3（STAT3）磷酸化水平；进一步比较两种分子诱导巨噬细胞吞噬红细胞的活性。结果解读：酶联免疫吸附实验结果显示，IL-10M-Fc对人外周血单个核细胞肿瘤坏死因子-α分泌的抑制活性显著弱于野生型IL-10-Fc；流式细胞术结果显示IL-10M-Fc介导的单核细胞STAT3磷酸化水平显著低于野生型IL-10-Fc；高浓度下IL-10M-Fc诱导的巨噬细胞红细胞吞噬活性显著弱于野生型IL-10-Fc（P<0.001，n=3），证实IL-10M活性显著降低，具备减轻血液学毒性的潜力。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用酶联免疫吸附试剂盒、流式磷酸化检测试剂等。

3.3 抗PD-1×IL-10M融合蛋白的设计与体外表征

实验目的：设计并构建抗PD-1×IL-10M融合蛋白，验证其保留亲本分子的生物学活性。方法细节：基于肿瘤浸润CD8+T细胞高表达PD-1和IL-10R的特征，设计将IL-10M通过连接肽连接到抗PD-1抗体重链或轻链C端，筛选最优连接方式；采用流式细胞术检测融合蛋白结合PD-1和IL-10R的活性；采用报告基因系统、葡萄球菌肠毒素B实验和混合淋巴细胞反应检测抗PD-1组分的功能；酶联免疫吸附和报告基因实验检测Fc段的效应功能。结果解读：体外实验显示IL-10M连接在轻链的融合蛋白抗肿瘤效果优于连接重链的形式，因此选择轻链连接型进行后续研究；融合蛋白对PD-1和IL-10R的结合活性与亲本分子相当，阻断PD-L1的活性与亲本抗PD-1抗体相当，促进干扰素-γ分泌的能力也与亲本抗体无显著差异；Fc段为改造的铰链稳定hIgG1 LALA突变体，与C1q的结合活性显著降低，不介导补体依赖的细胞毒性和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，有效避免了Fc段潜在的毒性风险，证实融合蛋白成功构建并保留了亲本分子的功能。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用细胞转染试剂、流式检测试剂、报告基因检测试剂盒等。

3.4 抗PD-1介导顺式结合增强融合蛋白活性验证

实验目的：验证抗PD-1×IL-10M通过顺式结合增强对耗竭CD8+T细胞激活活性的机制。方法细节：构建共表达IL-10R和PD-1的HEK报告细胞系，比较对照融合蛋白（Isotype×IL-10M）和抗PD-1×IL-10M的结合活性与报告基因活性；在体外诱导的耗竭CD8+T细胞中，检测融合蛋白的结合能力、STAT3磷酸化水平，以及对细胞凋亡、干扰素-γ分泌和肿瘤细胞杀伤能力的影响，同时设置抗PD-1抗体阻断组和IL-10R抑制剂组验证机制。结果解读：流式结合实验显示，抗PD-1×IL-10M对共表达PD-1和IL-10R的报告细胞结合活性显著高于Isotype×IL-10M；在PD-1过表达的报告细胞中，抗PD-1×IL-10M的报告基因活性显著高于Isotype×IL-10M，且该增强效应可被抗PD-1抗体阻断（P<0.05，n=3）；在体外诱导的耗竭CD8+T细胞中，抗PD-1×IL-10M的结合能力和STAT3磷酸化水平均显著高于对照，且可被抗PD-1抗体阻断；与抗PD-1单抗相比，抗PD-1×IL-10M显著降低耗竭CD8+T细胞凋亡（P<0.05，n=2），促进干扰素-γ分泌（P<0.001，n=2），显著增强耗竭CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力（P<0.001，n=3），且上述效应均可被IL-10R抑制剂逆转，证实抗PD-1×IL-10M通过顺式结合将IL-10M富集在PD-1+耗竭CD8+T细胞表面，增强IL-10通路激活和T细胞功能。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用细胞凋亡检测试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒等。

3.5 体内抗肿瘤活性与作用机制验证

实验目的：验证抗PD-1×IL-10M在体内的抗肿瘤活性与作用机制。方法细节：采用锆-89标记融合蛋白，PET成像检测融合蛋白在MC38荷瘤小鼠体内的生物分布；在CT26、MC38等多种荷瘤小鼠模型中评估抗肿瘤效果，流式细胞术检测肿瘤浸润免疫细胞亚群变化，单细胞RNA测序分析CD8+T细胞亚群的变化，免疫细胞清除实验明确抗PD-1×IL-10M发挥作用依赖的免疫细胞类型。结果解读：PET成像和生物分布结果显示，抗PD-1×IL-10M在给药后120h可显著富集在肿瘤组织，肿瘤肌肉摄取比显著高于Isotype×IL-10M（P<0.05，n=3）；体内抗肿瘤实验显示，抗PD-1×IL-10M呈剂量依赖性抑制肿瘤生长，效果显著优于抗PD-1单抗或野生型IL-10-Fc单药（P<0.0001，n=8）；流式细胞术结果显示，抗PD-1×IL-10M可显著增加肿瘤组织中CD3+CD8+T细胞比例，降低调节性T细胞比例（P<0.05，n=8），显著增加功能性干扰素-γ+颗粒酶B+CD8+T细胞比例，同时降低终末耗竭PD-1highTOXhighCD8+T细胞比例（P<0.05，n=8）；单细胞RNA测序结果显示，抗PD-1单药治疗后终末耗竭CD8+T细胞比例从对照组的23.2%升高至50.6%，而抗PD-1×IL-10M治疗后该比例降至37.4%，效应T细胞比例从抗PD-1组的4.7%升高至16.3%，证实IL-10M可对抗PD-1诱导的T细胞耗竭；免疫细胞清除实验显示，仅清除CD8+T细胞可完全消除抗PD-1×IL-10M的抗肿瘤效果，清除其他细胞类型无显著影响，证实抗PD-1×IL-10M主要通过CD8+T细胞发挥抗肿瘤作用。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用放射性标记试剂、单细胞测序建库试剂盒等。

3.6 多模型抗肿瘤验证与安全性评价

实验目的：在多种肿瘤模型验证抗PD-1×IL-10M的疗效，并在非人灵长类开展GLP毒性研究验证安全性。方法细节：在PD-1人源化小鼠的CT26、MC38、EMT6模型，以及PBMC人源化NOG小鼠的A375黑色素瘤模型中评估抗肿瘤效果，对治愈小鼠进行肿瘤再次攻击，验证免疫记忆的产生；体外检测融合蛋白诱导健康人外周血单个核细胞的细胞因子释放，在食蟹猴开展每周1次、共5次给药的GLP毒性研究，监测体重、血常规、肝肾功能、免疫细胞亚群等指标。结果解读：抗PD-1×IL-10M在多种肿瘤模型中均呈剂量依赖性抑制肿瘤生长，效果显著优于同等剂量的帕博利珠单抗，在抗PD-1耐药模型中也展现出显著的肿瘤生长抑制效果；治愈小鼠再次攻击肿瘤后全部排斥肿瘤生长，治疗后小鼠脾脏和淋巴结中CD8+中枢记忆T细胞比例显著升高（P<0.05，n=9），证实可诱导持久的免疫记忆；体外细胞因子释放实验显示，抗PD-1×IL-10M仅诱导低水平的IL-8，其他细胞因子几乎检测不到，细胞因子释放综合征风险低；GLP毒性研究显示，抗PD-1×IL-10M在最高10mg/kg剂量下，未出现白细胞、红细胞、血小板计数的显著降低，仅网状细胞计数轻度升高，无重度贫血迹象，肝肾功能指标均在正常范围内，最大耐受剂量为10mg/kg，证实其具有良好的安全性。

文献未提及具体实验产品，领域常规使用GLP毒理检测试剂、多因子检测试剂盒等。

4. Biomarker研究及发现成果

Biomarker定位：本研究中预测抗PD-1×IL-10M疗效的潜在生物标志物为PD-1+IL-10R+终末耗竭CD8+T细胞亚群，筛选逻辑为：基于肿瘤浸润T细胞的表型分析发现，终末耗竭CD8+T细胞高共表达PD-1与IL-10R，是抗PD-1×IL-10M的靶向作用对象，因此肿瘤中该细胞亚群的比例可预测药物对肿瘤的响应程度。

研究过程详述：该生物标志物的来源为肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞，通过流式细胞术或单细胞测序检测PD-1、IL-10R、TOX、TIM3等标志物的表达即可鉴定该细胞亚群；本研究在小鼠MC38肿瘤模型中证实，随着肿瘤体积增大，肿瘤内PD-1+IL-10R+CD8+T细胞比例显著升高，在抗PD-1治疗后该亚群比例进一步升高，抗PD-1×IL-10M可特异性靶向该亚群逆转其耗竭；在终末耗竭CD8+T细胞比例较高的晚期肿瘤模型（接种后14天给药，肿瘤平均体积＞200mm3）中，抗PD-1×IL-10M仍展现出显著优于抗PD-1单抗的抗肿瘤效果（P<0.001，n=9）。

核心成果提炼：PD-1+IL-10R+终末耗竭CD8+T细胞是抗PD-1×IL-10M的特异性作用靶点，该亚群比例越高，肿瘤对抗PD-1治疗越耐药，而抗PD-1×IL-10M可通过激活该亚群发挥抗肿瘤作用；推测：该亚群比例可作为预测抗PD-1×IL-10M临床疗效的生物标志物，未来需在大样本临床研究中验证其敏感性与特异性（文献未提供该生物标志物的ROC曲线及AUC数据）。本研究首次明确了该细胞亚群作为抗PD-1×IL-10M作用靶点的价值，为该药物的临床精准人群筛选提供了潜在标志物。