基于人类 iPSC 的肺纤维化模型揭示 p300/CBP 抑制可抑制肺泡过渡细胞状态。

1. 领域背景与文献

核心信息段：文献英文标题：Human iPSC-based Modeling of Pulmonary Fibrosis Reveals p300/CBP Inhibition Suppresses Alveolar Transitional Cell State；

发表期刊：Nature Communications；影响因子：17.6（2025年数据）；研究领域：特发性肺纤维化、人诱导多能干细胞模型、肺泡上皮细胞分化、表观遗传调控。

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性、致命性间质性肺疾病，中位生存期仅2-5年，现有临床药物（吡非尼酮、尼达尼布）仅能延缓疾病进展，无法逆转纤维化，且存在胃肠道不适等副作用。领域发展关键节点包括2014年FDA批准首批IPF治疗药物，近年单细胞转录组技术揭示肺泡过渡细胞状态（ATCS）在IPF中的核心致病作用，为机制研究与药物开发提供新方向。当前研究热点聚焦于ATCS的鉴定与调控机制、人源肺纤维化模型构建、靶向肺泡上皮细胞的药物开发等，但仍存在未解决的核心问题：人类ATCS与小鼠ATCS基因表达谱差异显著，小鼠模型结果难以直接转化至人类；缺乏稳定的人类ATCS体外模型，限制了针对该细胞群的药物筛选与机制解析；ATCS的分化调控机制尚不明确，尤其是表观遗传修饰的作用未被充分阐明。领域共识：特发性肺纤维化的发病机制与肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT2）功能障碍、异常分化密切相关，肺泡上皮细胞与成纤维细胞的异常互作是纤维化发生的关键环节。

针对上述研究空白，本研究旨在建立基于人诱导多能干细胞（iPSC）的肺纤维化模型，筛选可抑制ATCS的潜在治疗药物，并解析其调控机制，为IPF的治疗提供新靶点与策略。

2. 文献综述解析

核心信息段：作者对领域内现有研究的分类维度主要包括模型类型（小鼠模型与人类样本研究）、研究方向（ATCS的鉴定与功能、肺纤维化的细胞机制、药物筛选模型开发），通过对比不同模型的优势与局限性，凸显本研究在人源模型构建与机制解析方面的创新价值。

现有研究的关键结论包括：小鼠肺纤维化模型中ATCS是AT2向肺泡Ⅰ型上皮细胞（AT1）分化的中间过渡状态，异常诱导ATCS可促进纤维化发生，减少ATCS分化则可缓解纤维化；人类IPF患者肺组织中存在KRT5-/KRT17+的ATCS细胞亚群，且在纤维化区域异常积累，与疾病进展相关；现有药物筛选模型多基于小鼠细胞系或动物模型，虽能模拟部分纤维化表型，但难以还原人类肺纤维化的复杂细胞互作与病理特征。技术方法方面，小鼠模型便于基因操作与体内功能验证，单细胞转录组技术可精准鉴定细胞亚群与基因表达特征，但局限性显著：小鼠ATCS与人类ATCS基因表达谱存在明显差异，小鼠模型结果无法完全反映人类疾病病理过程；现有人类肺纤维化模型多为2D细胞培养，缺乏3D结构与细胞间互作，难以模拟体内纤维化的发生发展；针对ATCS的特异性药物筛选尚未取得突破性进展，缺乏可用于大规模药物筛选的人源ATCS模型。

本研究通过对比现有研究的不足，凸显了自身的创新价值：首次建立人iPSC来源的ATCS体外诱导与分离体系，所获得的iATCs与人类IPF患者肺组织中的ATCS具有高度相似的基因表达谱，为人类ATCS的机制研究与药物筛选提供了可靠模型；首次揭示p300/CBP表观遗传调控在人类ATCS分化中的核心作用，证明抑制p300/CBP可有效抑制ATCS分化并减轻肺纤维化，为IPF治疗提供了新靶点；开发基于人iPSC的3D肺纤维化模型（FD-AOs），可用于大规模药物筛选，筛选到的p300/CBP抑制剂在细胞与动物模型中均表现出显著抗纤维化作用，具有潜在临床转化价值。

3. 研究思路总结与详细解析

核心信息段：本研究的整体框架为“模型构建→药物筛选→机制解析→功能验证”的闭环：首先建立人iPSC来源的3D肺纤维化模型（FD-AOs），通过药物筛选发现p300/CBP抑制剂可抑制纤维化表型；随后在细胞与动物模型中验证其抗纤维化作用，并明确其作用靶点为ATCS；接着建立人iPSC来源ATCS（iATCs）的诱导与分离体系，通过单细胞多组学与表观遗传技术解析p300/CBP调控ATCS分化的机制；最后通过功能实验验证关键转录因子的作用，完善调控通路的解析。

3.1 基于人iPSC的BLM诱导肺纤维化模型构建与药物筛选

实验目的：建立可模拟人类肺纤维化病理特征的人源3D模型，并用于筛选可抑制纤维化的潜在治疗化合物。
方法细节：将人iPSC分化获得的AT2细胞与原代人胎儿肺成纤维细胞（HFLFs）共培养，构建成纤维细胞依赖型肺泡类器官（FD-AOs）；使用博来霉素（BLM）处理FD-AOs诱导纤维化表型，以类器官基质的凝胶收缩作为纤维化评价指标；采用包含264种临床前、临床及工具化合物的文库进行筛选，利用深度学习软件cellSens对凝胶面积进行定量分析，以TGFβ1受体抑制剂SB525334作为阳性对照，设定筛选标准为抑制凝胶收缩程度超过BLM组3倍标准差。
结果解读：筛选结果显示，文库中的8种p300/CBP抑制剂均被鉴定为阳性化合物，可有效抑制BLM诱导的FD-AOs凝胶收缩；其中CBP30和GNE781表现出剂量依赖性抑制作用，在1μM浓度下即可实现50%的凝胶收缩抑制，且无明显细胞毒性（排除NOXA基因高表达的假阳性样本）；在SFTPCGFP报告基因iPSC来源的FD-AOs中进一步验证了p300/CBP抑制剂的作用，结果显示处理后类器官凝胶面积显著增大（n=3-5，P<0.0001），表明其可有效抑制纤维化表型。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括iPSC培养基（Essential 8）、类器官分化培养基（DCIK+3i）、博来霉素（BLM）、流式抗体（EpCAM）、Illumina NovaSeq测序平台等。

3.2 p300/CBP抑制剂抗纤维化作用的细胞机制验证

实验目的：明确p300/CBP抑制剂抑制肺纤维化的细胞靶点及具体作用机制，区分其对上皮细胞与成纤维细胞的调控作用。
方法细节：通过EpCAM抗体磁珠分选FD-AOs中的上皮细胞与成纤维细胞，分别进行bulk RNA-seq分析；在成纤维细胞单独3D培养体系中加入TGFβ1诱导凝胶收缩，同时加入p300/CBP抑制剂，观察其对成纤维细胞的直接作用；构建TRF2DN诱导的衰老型肺纤维化模型，通过DOX诱导AT2细胞端粒功能障碍与衰老，验证p300/CBP抑制剂对该模型纤维化表型的抑制作用；通过免疫荧光染色检测活性p300、ATCS标记物SFN的表达变化，定量分析阳性细胞比例。
结果解读：RNA-seq结果显示，p300/CBP抑制剂处理后，成纤维细胞中肌成纤维细胞标记物CTHRC1、ACTA2的表达显著下调，细胞外基质（ECM）生成相关通路被显著抑制；上皮细胞中ATCS标记物的表达明显降低，提示p300/CBP抑制剂可抑制ATCS的分化；在成纤维细胞单独培养体系中，p300/CBP抑制剂无法抑制TGFβ1诱导的凝胶收缩，表明其抗纤维化作用依赖于对肺泡上皮细胞的调控；免疫荧光结果显示，BLM处理后FD-AOs上皮细胞中活性p300与SFN的表达显著增加，而p300/CBP抑制剂处理可显著降低两者的阳性细胞比例（n=3，P<0.001）；在TRF2DN衰老模型中，p300/CBP抑制剂可有效抑制类器官凝胶收缩，上调AT2标记物SFTPC、SFTPA2的表达，下调ATCS标记物，逆转衰老导致的AT2细胞功能障碍。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括RNA提取试剂盒（RNeasy Micro Kit）、免疫荧光抗体（活性p300、SFN、EpCAM）、流式分选磁珠、qPCR引物等。

3.3 p300/CBP抑制剂在小鼠肺纤维化模型中的体内验证

实验目的：验证p300/CBP抑制剂在体内肺纤维化模型中的抗纤维化作用，明确其对体内ATCS的调控效果。
方法细节：建立BLM诱导的小鼠肺纤维化模型，在造模后第2、4、6天经口咽给予p300/CBP抑制剂CBP30（10mg/kg），第7天收集小鼠肺组织；通过qPCR检测肺组织中纤维化标记物与ATCS标记物的基因表达水平；通过免疫荧光染色检测肺组织中活性p300、SFN（ATCS标记物）、ACTA2（肌成纤维细胞标记物）的表达，定量分析阳性细胞比例与ACTA2覆盖率。
结果解读：qPCR结果显示，CBP30处理后小鼠肺组织中纤维化标记物（如ACTA2、COL1A1）的表达显著降低（n=6-8，P<0.05），ATCS标记物的表达也明显下调（n=6-8，P<0.001）；免疫荧光结果显示，BLM诱导的小鼠肺组织中活性p300+细胞与SFN+细胞数量显著增加，而CBP30处理可显著减少两者的阳性细胞比例（n=3，P<0.001）；同时，CBP30处理可显著降低ACTA2阳性肌成纤维细胞的组织覆盖率（n=3，P<0.01），表明其可有效抑制体内纤维化的发生发展。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括BLM、CBP30、qPCR引物、免疫荧光抗体（活性p300、SFN、ACTA2）等。

3.4 人iPSC来源肺泡过渡细胞（iATCs）的诱导与鉴定

实验目的：建立人iPSC来源ATCS的体外诱导体系，鉴定其与人类IPF患者ATCS的相似性，明确其分子特征。
方法细节：在微图案化培养板中，将人iPSC分化获得的肺祖细胞（LPCs）用PneumaCult-ALI（PAL+）培养基诱导分化为iATCs；通过单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析iATCs的基因表达谱，与人类IPF患者ATCS的公开单细胞数据进行比较；通过单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）分析iATCs的染色质开放状态，鉴定调控其分化的关键转录因子结合基序。
结果解读：scRNA-seq结果显示，iATCs高表达ATCS标记物（如SFN、KRT17），与人类IPF患者肺组织中ATCS的基因表达谱高度相关（相关系数为0.84），而与AT2细胞的相关性较低（相关系数为0.19），表明iATCs可有效模拟人类IPF患者的ATCS；scATAC-seq结果显示，iATCs的染色质开放区域富集AP-1、TP53、TP63等转录因子结合基序，与AT2、AT1细胞的染色质开放状态存在显著差异，提示这些转录因子可能参与调控iATCs的分化与维持。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括微图案化培养板、scRNA-seq文库构建试剂盒、scATAC-seq文库构建试剂盒、MGI DNBSEQ-T7RS测序平台等。

3.5 iATCs的分离及功能验证

实验目的：建立iATCs的特异性分离方法，验证其对成纤维细胞的激活作用及分化可塑性，明确其在肺纤维化中的功能。
方法细节：通过流式细胞术分选CD54+的iATCs，验证CD54作为iATCs表面标记的特异性；将分离的CD54+ iATCs与正常人成年肺成纤维细胞（NHLFs）共培养，通过qPCR检测成纤维细胞中纤维化标记物的表达变化；将CD54+ iATCs分别用AT2诱导培养基（DCIK+3i）与AT1诱导培养基（DCI+LATSi）培养，通过qPCR与HiBiT实验检测细胞标记物的表达变化，验证其分化可塑性。
结果解读：流式细胞术与免疫荧光结果显示，CD54在iATCs中特异性高表达，而在AT2与AT1细胞中表达量极低，分选的CD54+细胞高表达ATCS标记物（n=3，P<0.001），表明CD54可作为iATCs的特异性表面标记；与NHLFs共培养后，成纤维细胞中POSTN、CTHRC1、COL1A1等纤维化标记物的表达显著上调（n=3，P<0.05），表明iATCs可直接激活成纤维细胞向肌成纤维细胞转化；分化可塑性实验显示，CD54+ iATCs在AT2诱导培养基中可分化为功能型AT2细胞，AT2标记物SFTPC的表达显著上调（n=6，P<0.05），而ATCS标记物表达下调；在AT1诱导培养基中可直接分化为AT1细胞，AT1标记物AGER的表达显著上调（n=5，P<0.05），ATCS标记物表达下调，表明iATCs具有向AT2与AT1双向分化的可塑性。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括流式抗体（CD54）、细胞分选仪、共培养培养基、HiBiT检测试剂盒等。

3.6 p300/CBP调控iATCs分化的表观遗传机制解析

实验目的：解析p300/CBP调控iATCs分化的表观遗传机制，鉴定下游关键转录因子与调控通路。
方法细节：对iATCs、AT2、AT1细胞进行H3K27ac CUT&Tag分析，鉴定调控细胞分化的表观遗传标记；对p300/CBP抑制剂处理的iATCs进行H3K27ac CUT&Tag分析，明确p300/CBP调控的表观遗传区域；对BLM处理的FD-AOs进行p300 CUT&Tag分析，鉴定p300结合的调控区域与转录因子结合基序；通过siRNA敲低AP-1家族成员ATF3与转录因子HNF1B，验证其在iATCs分化中的作用。
结果解读：H3K27ac CUT&Tag结果显示，iATCs中ATCS标记物基因区域富集H3K27ac峰，而p300/CBP抑制剂处理后这些峰显著减少，表明p300/CBP通过调控H3K27ac修饰调控ATCS标记物的表达；motif分析显示，iATCs中H3K27ac峰富集AP-1与HNF1B结合基序，p300/CBP抑制剂处理后这些基序相关的H3K27ac峰显著减少；p300 CUT&Tag结果显示，BLM处理后FD-AOs上皮细胞中p300结合区域富集AP-1、HNF1B等转录因子结合基序，且随时间动态变化；siRNA敲低ATF3或HNF1B后，iATCs中ATCS标记物的表达显著下调（n=3-4，P<0.001），表明AP-1与HNF1B是p300/CBP下游调控iATCs分化的关键转录因子。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括CUT&Tag试剂盒、抗体（H3K27ac、p300）、siRNA转染试剂、qPCR引物等。

4. Biomarker研究及发现成果

核心信息段：本研究涉及的Biomarker包括肺泡过渡细胞状态（ATCS）的细胞标记物CD54、表观遗传标记物H3K27ac、调控ATCS分化的关键转录因子AP-1（ATF3）与HNF1B，以及调控因子p300/CBP，筛选与验证逻辑为“模型构建→标记鉴定→机制解析→功能验证”，通过多组学技术与功能实验明确了这些Biomarker在肺纤维化中的作用与临床价值。

Biomarker定位方面，ATCS是IPF中的关键致病细胞群，本研究中建立的iATCs模型模拟了人类IPF患者的ATCS，CD54作为iATCs的特异性表面标记，可用于分离与检测人类ATCS；H3K27ac是p300/CBP的直接靶标，可作为ATCS激活的表观遗传标记，反映ATCS的分化状态；p300/CBP是调控ATCS分化的核心表观遗传调控因子，其抑制剂可靶向ATCS发挥抗纤维化作用；AP-1（ATF3）与HNF1B是p300/CBP下游调控ATCS分化的关键转录因子，为IPF治疗提供了新靶点。

研究过程详述包括：CD54的特异性通过流式细胞术与免疫荧光实验验证，分选的CD54+ iATCs高表达ATCS标记物（n=3，P<0.001），且与人类IPF患者ATCS的基因表达谱高度相关；H3K27ac通过CUT&Tag与免疫荧光实验检测，p300/CBP抑制剂处理后iATCs中H3K27ac水平显著降低（n=3，P<0.001）；p300/CBP的调控作用通过药物筛选、细胞与动物实验验证，其抑制剂可有效抑制ATCS分化与纤维化；AP-1与HNF1B通过motif分析、CUT&Tag与siRNA实验验证，敲低后ATCS标记物表达显著下调（n=3-4，P<0.001）。

核心成果提炼包括：CD54可作为人类ATCS的潜在临床Biomarker，用于IPF患者肺组织中ATCS的分离与检测，为疾病诊断与预后评估提供新指标；p300/CBP是IPF治疗的潜在药物靶点，其抑制剂可通过抑制ATCS分化发挥抗纤维化作用，具有良好的临床转化前景；AP-1与HNF1B是p300/CBP下游调控ATCS的关键转录因子，为IPF的精准治疗提供了新靶点；iATCs具有双向分化可塑性，提示IPF患者中的ATCS可能并非终末分化状态，通过干预p300/CBP等调控因子可逆转其分化方向，为IPF的逆转治疗提供了新思路；本研究建立的人iPSC来源肺纤维化模型与iATCs诱导体系，为IPF的机制研究与药物筛选提供了可靠的实验平台。