二甲双胍甘草次酸二元注射水凝胶通过时空微环境重塑实现协同肿瘤免疫治疗。
Metformin glycyrrhetinic acid binary injectable hydrogel for synergistic tumor immunotherapy via spatiotemporal microenvironment remodeling.
1. 领域背景与文献
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤免疫治疗，可注射水凝胶药物递送系统。领域共识：当前免疫检查点阻断疗法是肿瘤免疫治疗的主流方案，但该疗法整体应答率仅为5%~30%，还会引发结肠炎等免疫相关不良反应，其疗效瓶颈核心来源于免疫抑制性肿瘤微环境。免疫抑制性肿瘤微环境的核心特征包括PD-L1介导的免疫检查点通路异常激活抑制T细胞功能、M2型肿瘤相关巨噬细胞主导的免疫调控失衡通过分泌免疫抑制因子促进免疫耐受、效应免疫细胞浸润受损导致免疫监视功能减弱，多因素相互作用形成多维免疫抑制网络，最终促进肿瘤免疫逃逸。
纳米药物是肿瘤免疫治疗中极具潜力的药物递送 modality，在重编程巨噬细胞、下调PD-L1表达、逆转免疫抑制性肿瘤微环境方面展现出明确应用价值。全球目前已有62种纳米药物获批上市，超过500种处于临床试验阶段，其中53%靶向肿瘤领域。但传统纳米载体存在载药量低（低于10%重量比）、载体与药物功能解耦的核心缺陷，限制了治疗效果；无载体纳米药物虽然解决了上述问题，但仍存在肿瘤积累效率极低（低于1%）的瓶颈。在此背景下，天然无载体小分子自组装水凝胶凭借载药量高、无需外源惰性载体、病灶积累效果好的优势，成为新型药物递送系统的研究热点。二甲双胍是2型糖尿病一线治疗药物，近年来被证实具有明确的免疫调节作用，可通过内质网相关降解促进PD-L1降解，重编程M2型肿瘤相关巨噬细胞向M1型转化，抑制线粒体复合物I重塑肿瘤微环境，全球已有869项二甲双胍相关临床试验完成或正在开展。但二甲双胍属于BCS III类药物，溶解度高难以自组装形成可注射水凝胶，限制了其在该递送体系中的应用。因此，本研究针对亲水小分子难以制备自组装水凝胶的研究空白，构建基于二甲双胍甘草酸盐的光热响应可注射水凝胶，探索其时空重塑肿瘤免疫微环境、协同提升免疫治疗效果的应用价值，为可注射免疫治疗水凝胶的临床转化提供新范式。
2. 文献综述解析
作者按照肿瘤纳米药物递送系统的发展脉络对现有研究进行分类梳理，明确不同类型递送系统的优势与局限性。首先针对传统纳米载体，现有研究已经证实这类系统可有效实现重编程巨噬细胞、下调PD-L1表达，部分传统纳米载体药物已经获批上市，技术成熟度高，但传统纳米载体普遍存在载药量低于10%重量比、载体与治疗药物功能解耦的问题，难以充分发挥治疗效果。针对无载体纳米药物，现有研究表明这类系统解决了传统纳米载体载药量低和功能解耦的缺陷，但无载体纳米药物的肿瘤积累效率不足1%，大部分药物无法有效富集于肿瘤部位，治疗效果受限。针对小分子自组装水凝胶，现有研究已经证实这类系统可实现最高100%的载药量，无需外源惰性载体，可有效提升病灶部位药物积累，是极具潜力的递送系统，但现有研究中亲水小分子药物因溶解度高难以自组装形成凝胶，限制了二甲双胍等亲水免疫调节药物在该体系中的应用。
基于对现有研究的梳理，本研究的创新价值与学术必要性清晰凸显：本研究首次利用课题组开发的亲脂性驱动成盐策略，将高亲水性的二甲双胍与疏水性的甘草酸结合构建两亲性二甲双胍甘草酸盐，解决了二甲双胍难以自组装成凝胶的问题；进一步引入美国食品药品监督管理局批准的四氧化三铁纳米粒，实现近红外光触发凝胶化，得到具有时空控释能力的可注射复合水凝胶；该体系所有核心组分均为临床批准化合物，规避了新化学实体开发的安全性风险，兼具制备简单和临床转化潜力大的优势；同时该体系通过免疫原性细胞死亡诱导、M2型肿瘤相关巨噬细胞重编程、增强CD8阳性T细胞浸润三重机制协同逆转免疫抑制性肿瘤微环境，可有效提升免疫检查点阻断疗法的疗效，填补了亲水免疫调节小分子难以制备自组装可注射水凝胶的研究空白，为下一代肿瘤联合免疫治疗提供了监管友好的设计蓝图。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究整体研究目标为构建可时空调控药物释放的二甲双胍甘草酸二元可注射水凝胶，实现免疫抑制性肿瘤微环境的协同重塑，提升肿瘤免疫治疗效果；核心科学问题为如何解决二甲双胍高亲水性难以自组装成凝胶的缺陷，如何实现可注射水凝胶的时空控释与多机制协同免疫调节；技术路线遵循“问题提出→材料合成→结构表征→机制阐明→体外验证→体内验证→联合治疗验证”的闭环逻辑，从分子水平到动物水平逐步验证该体系的治疗效果与作用机制。
3.1 二甲双胍甘草酸盐的合成与结构表征
实验目的：通过亲脂性成盐策略合成二甲双胍甘草酸盐，解决二甲双胍高亲水性无法自组装成凝胶的问题，验证合成产物的分子结构与溶解度提升效果。方法细节：首先将盐酸二甲双胍用氢氧化钾中和得到游离二甲双胍，旋蒸除溶剂后甲醇沉淀去除氯化钾，浓缩得到纯化游离二甲双胍；之后将游离二甲双胍与18β-甘草酸按比例加入甲醇，50℃持续搅拌反应24小时，旋蒸得到粗产物；采用氢核磁共振波谱、傅里叶变换红外光谱、紫外-可见光谱、差示扫描量热法、粉末X射线衍射对产物结构进行表征，最后检测产物在水中的溶解度。结果解读：结构表征结果显示，氢核磁共振波谱中甘草酸C30羧基质子特征峰完全消失，二甲双胍甲基质子信号从δ2.8ppm向低场移动至δ3.0ppm，位移变化符合盐形成的特征；傅里叶变换红外光谱显示，甘草酸1710cm-1处的-COOH伸缩振动消失，1557cm-1处出现羧酸根不对称伸缩振动带，同时氨基伸缩振动发生位移，证实二甲双胍质子化氨基与甘草酸羧酸根成功成盐；粉末X射线衍射显示原料的结晶特征峰完全消失，在2θ为28.43°和15.16°处出现新的宽峰，证实形成了新的分子结构；溶解度检测结果显示，甘草酸的溶解度从34.93±4.97μg/mL提升至23.81±3.44mg/mL，提升幅度约680倍，显著改善了甘草酸的水溶性，同时赋予体系凝胶化能力。文献未提及具体实验产品，领域常规使用有机合成试剂与光谱表征类仪器。
3.2 四氧化三铁复合水凝胶的制备与性能表征
实验目的：引入四氧化三铁纳米粒实现近红外光触发凝胶化，表征复合水凝胶的结构、流变性能、光热性能与药物释放行为，验证其符合可注射水凝胶的应用要求。方法细节：采用溶剂热法合成四氧化三铁纳米粒，将不同浓度的二甲双胍甘草酸盐分散于超纯水，加入四氧化三铁纳米粒后通过加热-冷却循环诱导凝胶化，得到Fe3O4NPs@Met-GA-H复合水凝胶；采用扫描电子显微镜、能量色散X射线光谱、X射线光电子能谱表征复合水凝胶的结构与元素分布，采用流变仪表征流变性能，检测不同四氧化三铁浓度、不同激光功率下的光热性能，采用高效液相色谱检测近红外触发下的药物释放行为。结果解读：扫描电子显微镜结果显示复合水凝胶具有均匀的多孔网络结构，四氧化三铁纳米粒均匀分散于凝胶基质中，元素分布检测证实碳、氮、氧、铁元素均匀分布；流变学测试结果显示，复合水凝胶的临界应变阈值为26.79%，储存模量在0.1~100rad/s的频率范围内始终高于损耗模量，具有稳定的结构，同时具备快速自愈合能力与剪切稀化行为，符合可注射水凝胶的流变学要求；光热性能检测显示，在0.98W/cm²的808nm近红外照射下，复合水凝胶的最大温升可达39.3℃，经过5次开/关循环仍保持良好的光热稳定性，凝胶基质不会影响四氧化三铁纳米粒的光热性能；药物释放实验显示，无近红外照射时72小时内二甲双胍累积释放率为57.37%，符合缓慢释放特征，近红外照射下累积释放率提升至82.49%，实现近红外触发的快速释放，而甘草酸120小时内累积释放率不足30%，这种阶段释放模式可实现水溶性二甲双胍的快速起效与甘草酸的长期维持，延长抗肿瘤效果。文献未提及具体实验产品，领域常规使用纳米材料合成仪器与流变、色谱类表征设备。
3.3 水凝胶自组装机制研究
实验目的：从热力学与分子水平阐明二甲双胍甘草酸水凝胶自组装的分子驱动力，明确自组装过程的动态变化。方法细节：采用等温滴定量热法检测二甲双胍与甘草酸结合的热力学参数，验证结合过程的自发性与驱动力类型；开展全原子分子动力学模拟，分析自组装过程中分子均方根偏差、溶剂可及表面积、分子间氢键数量与相互作用能的变化，捕捉自组装过程的动态快照；加入氢键抑制剂尿素、离子键抑制剂氯化钠、疏水相互作用抑制剂曲拉通X-100，验证不同相互作用在自组装中的作用。结果解读：等温滴定量热法结果显示，二甲双胍与甘草酸结合的吉布斯自由能为负值，结合过程自发进行，焓变为负、熵与温度的乘积为正，表明结合过程主要由静电相互作用或氢键驱动；分子动力学模拟结果显示，体系在15纳秒后达到热力学稳定，自组装过程中溶剂可及表面积逐渐降低，范德华力是自组装的主要驱动力，平均相互作用能为-61.40±5.50kJ/mol，氢键与静电相互作用发挥辅助作用，自组装过程中亲水的二甲双胍逐渐聚集形成外层，疏水的甘草酸向内部迁移形成核-壳结构，显著降低体系自由能，提升结构稳定性；抑制剂实验结果显示，三种抑制剂均可浓度依赖性破坏凝胶结构，证实氢键、离子键、疏水相互作用共同参与自组装过程，与热力学和模拟结果一致。文献未提及具体实验产品，领域常规使用量热仪器与分子动力学模拟软件。
3.4 体外治疗效果与免疫调节功能验证
实验目的：验证复合水凝胶的体外选择性抗肿瘤活性，以及诱导免疫原性细胞死亡、重编程M2型巨噬细胞、下调PD-L1的免疫调节功能。方法细节：采用细胞计数试剂盒-8检测不同处理对B16-F10黑色素瘤细胞和正常人类永生化角质形成细胞HaCaT的毒性，计算联合指数验证二甲双胍与甘草酸的协同效应；建立肿瘤细胞-巨噬细胞共培养模型，通过活/死细胞染色、流式细胞术凋亡检测验证不同处理的抗肿瘤效果；通过免疫荧光染色检测免疫原性细胞死亡标志物高迁移率族蛋白B1、钙网蛋白的定位变化，通过试剂盒检测ATP分泌水平，验证免疫原性细胞死亡诱导效果；将RAW264.7巨噬细胞经白细胞介素4诱导为M2型，不同处理后通过免疫荧光染色检测M1标志物CD86、诱导型一氧化氮合酶与M2标志物CD206的表达，验证巨噬细胞重编程效果；通过免疫荧光染色检测B16-F10细胞PD-L1表达变化，验证PD-L1下调效果。结果解读：细胞毒性实验结果显示，二甲双胍甘草酸盐对B16-F10细胞的半抑制浓度比游离二甲双胍低188.9倍，联合指数为0.80，证实二甲双胍与甘草酸存在明确的协同抗肿瘤效应；在100μM浓度下，二甲双胍甘草酸盐仍可保持HaCaT细胞95%以上的活力，显著降低游离甘草酸的非特异性毒性，具有良好的生物相容性；共培养体系结果显示，近红外照射下的复合水凝胶诱导B16-F10细胞活力降低至13.0%（n=6，P<0.001），凋亡率达到81.37±0.86%（n=3，P<0.001），同时对巨噬细胞毒性低，巨噬细胞活力保持92%以上（n=3），具有肿瘤选择性毒性；免疫原性细胞死亡检测结果显示，近红外照射下的复合水凝胶处理组，核内高迁移率族蛋白B1荧光强度降低至272.76±35.74（n=3），膜表面钙网蛋白表达升高至对照组的1.53倍（n=3，P<0.001），ATP分泌升高至对照组的4.68倍，证实可有效诱导免疫原性细胞死亡；巨噬细胞重编程结果显示，近红外照射下的复合水凝胶处理组，CD86和诱导型一氧化氮合酶表达较白细胞介素4诱导组分别升高3.26倍和3.83倍（n=3，P<0.001），CD206表达恢复至对照组水平，证实可有效促进M2型巨噬细胞向M1型极化；PD-L1表达检测结果显示，二甲双胍是PD-L1下调的主要驱动因子，复合水凝胶保留了二甲双胍的PD-L1下调能力，四氧化三铁介导的光热效应可进一步增强内质网应激，促进PD-L1降解。实验所用关键产品：Abcam的抗钙网蛋白抗体（货号ab92516）、抗高迁移率族蛋白B1抗体（货号ab79823），BioLegend的系列流式抗体，Solarbio的细胞培养及检测相关试剂。
3.5 体内抗肿瘤疗效与免疫激活验证
实验目的：在B16-F10黑色素瘤荷瘤小鼠模型中验证复合水凝胶的体内抗肿瘤疗效、生物安全性与免疫激活效应。方法细节：将荧光素酶标记的B16-F10细胞皮下接种于C57BL/6小鼠右侧胁部，待肿瘤体积达到约100mm³后，将小鼠随机分为4组（n=5），分别给予磷酸盐缓冲液、二甲双胍甘草酸水凝胶、复合水凝胶、复合水凝胶联合近红外照射，采用瘤内注射给药，近红外组给予808nm激光0.98W/cm²照射10分钟；定期通过生物发光成像监测肿瘤生长，实验终点处死后测量肿瘤重量，计算肿瘤生长抑制率；通过主要器官组织病理学染色、血清肝肾功能生化指标检测评估生物安全性；通过免疫荧光染色、流式细胞术检测肿瘤组织和脾脏中免疫细胞的激活与浸润情况。结果解读：治疗结果显示，复合水凝胶联合近红外照射组肿瘤生物发光强度仅为对照组的2.1倍，肿瘤生长抑制率达到89.53±9.25%（n=5，P<0.001），显著高于其他单一治疗组；体内滞留实验显示，复合水凝胶可在肿瘤部位长期滞留，30天可完全降解，符合单次注射治愈的治疗策略；生物安全性评估结果显示，所有治疗组小鼠主要器官组织结构正常，血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素、肌酐等肝肾功能指标均在正常生理范围内，与对照组无显著差异，证实该复合水凝胶具有良好的体内生物安全性；免疫激活检测结果显示，复合水凝胶联合近红外照射组肿瘤组织中高迁移率族蛋白B1和钙网蛋白表达分别为对照组的9.86倍和15.20倍（n=5，P<0.001），CD86表达升高至7.41±1.16，CD206表达降低至0.76±0.35，PD-L1表达降低4.25倍，脾脏中成熟树突状细胞比例升高至15.72±0.98%（n=5，P<0.001），肿瘤组织中CD8阳性T细胞浸润升高至对照组的4.85倍（n=5，P<0.001），证实该体系可有效激活系统性抗肿瘤免疫，逆转免疫抑制性肿瘤微环境。实验所用关键产品：MeilunBio的D-萤光素钾盐（货号MB1834-3），MedChemExpress的抗小鼠PD-1抗体（货号S-5001）。
3.6 联合免疫检查点阻断治疗验证
实验目的：验证复合水凝胶联合抗PD-1治疗的协同抗肿瘤效果，明确其临床应用潜力。方法细节：构建B16-F10皮下荷瘤小鼠模型，随机分为4组（n=5），分别为对照组、抗PD-1单药组、复合水凝胶联合近红外组、复合水凝胶联合近红外加抗PD-1联合组，瘤内注射给药后，分别在第2、4、6天腹腔注射给予抗PD-1或磷酸盐缓冲液，治疗15天后处死小鼠，检测肿瘤生长抑制率与免疫激活情况。结果解读：联合治疗结果显示，复合水凝胶联合抗PD-1组肿瘤生长抑制率达到81.40±15.08%（n=5，P<0.001），显著高于单一抗PD-1治疗组与复合水凝胶单治疗组；免疫检测结果显示，联合治疗组脾脏中主要组织相容性复合体II阳性树突状细胞比例为55.98±0.54%（n=5，P<0.001），成熟树突状细胞比例为19.32±0.54%（n=5，P<0.001），脾脏中CD8阳性T细胞比例达到9.94±1.36%（n=5，P<0.001），是对照组的4.97倍，肿瘤相关巨噬细胞的M1/M2比值达到10.33±3.04（n=5，P<0.001），显著高于单一治疗组，证实复合水凝胶通过重塑免疫抑制性肿瘤微环境，可有效提升免疫检查点阻断治疗的疗效，具有良好的临床转化潜力。文献未提及具体实验产品，领域常规使用动物实验相关试剂与检测设备。
4. Biomarker研究及发现成果
本研究涉及的生物标志物均为肿瘤免疫微环境重塑与免疫治疗疗效评估的功能标志物，具体包括PD-L1（免疫检查点分子）、CD86（M1型肿瘤相关巨噬细胞标志物）、CD206（M2型肿瘤相关巨噬细胞标志物）、CD4+与CD8+T细胞（效应免疫细胞浸润标志物）；筛选与验证逻辑围绕免疫抑制性肿瘤微环境的三个核心特征展开，首先在体外细胞实验中通过免疫荧光染色验证治疗对标志物表达的影响，之后在荷瘤小鼠肿瘤组织中通过免疫荧光染色与流式细胞术进一步验证，明确不同治疗对肿瘤微环境的重塑效果，最后在联合治疗中验证标志物表达变化与治疗疗效的相关性。
本研究中所有标志物均来自肿瘤组织与脾脏免疫细胞，验证方法包括免疫荧光染色定量、流式细胞术定量，核心数据如下：复合水凝胶联合近红外照射处理后，PD-L1表达较对照组降低4.25倍（n=5，P<0.001），CD86表达升高7.41倍（n=5，P<0.001），CD206表达降低10.37倍（n=5，P<0.001），CD4+T细胞浸润升高2.96倍（n=5，P<0.001），CD8+T细胞浸润升高4.85倍（n=5，P<0.001），联合抗PD-1治疗后M1/M2比值达到10.33±3.04（n=5，P<0.001），CD8阳性T细胞浸润进一步提升。
本研究的核心成果为：首次明确了二甲双胍甘草酸自组装复合水凝胶对肿瘤免疫微环境相关标志物的调控作用，证实该体系可通过下调PD-L1、促进M2型肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化、增加效应T细胞浸润，有效将免疫抑制性的“冷”肿瘤转化为免疫激活的“热”肿瘤，这些标志物的变化与抗肿瘤疗效、免疫激活程度显著相关，可有效预测该治疗方案的响应情况。本研究首次将二甲双胍甘草酸自组装水凝胶用于肿瘤免疫微环境重塑，证实了该体系对免疫相关标志物的调控作用，为后续临床转化与疗效预测提供了分子依据。
