在骨肉瘤PDX类器官交互式生物样本库中重建T细胞浸润，用于个性化免疫治疗。
Reconstruction of T cell infiltration in an osteosarcoma PDX-organoid interactive biobank for personalized immunotherapy.
1. 领域背景与文献
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：骨肿瘤学，肿瘤免疫治疗，类器官模型开发。
骨肉瘤是主要好发于儿童和青少年的高度恶性原发性骨肿瘤，领域共识：近四十年来，尽管治疗技术有所进步，骨肉瘤患者的生存结局并未得到明显提升，一线治疗失败的复发转移患者预后极差，生存率降至20%及以下，且缺乏有效的挽救治疗手段。免疫治疗在多种实体瘤中已展现出突出疗效，但在骨肉瘤中的疗效十分有限。由于骨肉瘤发病率较低，每百万人仅3-5例，严重阻碍了骨肉瘤个性化免疫治疗的临床与转化研究。
现有骨肉瘤免疫治疗研究模型无法反映对治疗至关重要的患者特异性差异：免疫活性小鼠来源异种移植模型通常缺乏临床病例中存在的特征性突变和驱动特征，导致许多在临床前阶段表现出前景的免疫治疗策略在后续临床试验中失败；近十年发展起来的患者源性异种移植（PDX）模型虽然可保留患者肿瘤的遗传特征，但裸鼠构建的PDX模型无法保留患者特异性免疫特征，而人源化PDX模型会给儿童青少年患者带来过高的经济和身体负担，不适合广泛临床转化。随着类器官模型的应用推广，传统PDX模型逐渐显现出局限性，但由于骨肉瘤发病率低，建立全面成熟的骨肉瘤类器官生物库需要大量时间，且现有类器官模型虽然可保留肿瘤的遗传异质性，传代过程中肿瘤浸润淋巴细胞会发生活化诱导的耗竭，导致传代中丢失免疫特征，同时已报道的骨肉瘤类器官直径仅约100微米，无法完整重现骨肉瘤微环境的空间特征。因此，领域迫切需要能够同时保留骨肉瘤遗传异质性和免疫特征、可准确模拟骨肉瘤微环境的过渡模型，填补PDX模型和新一代临床转化模型之间的空白，本研究针对这一核心问题构建交互式PDX-类器官生物库，重建T细胞浸润，为骨肉瘤个性化免疫治疗研究提供可靠的转化平台，解决了现有模型的核心缺陷。
2. 文献综述解析
作者按照现有研究模型的类型对领域内现有研究进行分类梳理，依次分析免疫活性小鼠异种移植模型、传统PDX模型、传统类器官模型三类模型的优势与局限性。免疫活性小鼠来源异种移植模型可用于免疫相关机制研究，已经构建了K7系列、DuNN系列等多个模型，但这类模型缺乏临床病例的特征突变和驱动特征，临床前研究结果向临床试验转化的失败率高，无法满足个性化治疗研究需求。传统PDX模型经过近十年发展已经建立了多个综合性PDX生物库，可保留患者肿瘤的遗传特征，但裸鼠PDX模型无法保留患者特异性免疫特征，人源化PDX模型的成本与负担过高，不适合儿童青少年骨肉瘤患者的广泛临床转化。传统类器官模型近年在肿瘤研究中应用越来越广泛，可保留原发肿瘤的遗传异质性，但由于骨肉瘤发病率低，构建大规模成熟的骨肉瘤类器官生物库耗时久，且类器官传代过程中肿瘤浸润淋巴细胞会发生耗竭，导致免疫特征丢失，现有骨肉瘤类器官尺寸过小，无法重现肿瘤微环境的空间特征。
现有研究中，已有的肉瘤类器官库覆盖多种骨与软组织肉瘤，但并非骨肉瘤特异性，也很少整合系统配对的多组学数据用于分子验证；少数已报道的骨肉瘤类器官研究仅基于少量患者样本证实了转录组一致性，领域仍然缺乏大样本量、带有完整基因组注释的骨肉瘤特异性类器官队列，无法为精准医学研究提供可靠的模型支撑。本研究的创新点在于首次构建了大样本量、多组学完整注释的骨肉瘤特异性PDX-类器官交互式生物库，通过自组装策略获得毫米级尺寸的类器官，可完整重现骨肉瘤的空间微环境特征，进一步通过外周血单个核细胞共培养成功重建了T细胞浸润，解决了现有类器官模型免疫特征丢失的核心问题，同时利用该平台验证了Chr9p21.3缺失亚型骨肉瘤的个性化联合免疫治疗策略，为骨肉瘤免疫治疗药物开发和临床转化提供了全新的可推广平台，填补了领域研究空白。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体研究目标是构建可用于骨肉瘤个性化免疫治疗研究的交互式PDX-类器官生物库，核心科学问题是如何解决现有模型无法同时保留骨肉瘤遗传异质性、空间特征和免疫微环境特征的缺陷，建立适合临床转化的研究平台。技术路线遵循“样本收集与PDX构建→类器官自组装培养→模型多组学与病理特征验证→T细胞浸润重建→临床药物敏感性验证→个性化治疗方案验证”的完整闭环，实现从模型构建到临床转化应用的全流程研究。
3.1 骨肉瘤PDX-类器官交互式生物库构建
实验目的：建立大样本量的骨肉瘤类器官生物库，优化培养体系获得可重现实体肿瘤微环境特征的毫米级类器官。方法细节：收集93例骨肉瘤患者的原发肿瘤或PDX组织样本，选择无坏死的样本经酶解消化获得高活度单细胞悬液，在优化培养条件下通过自组装法构建个性化骨肉瘤类器官，统计建库成功率；对不同直径的类器官进行多重免疫荧光（mIF）染色，检测增殖、缺氧、凋亡相关标志物的表达；同时将构建好的类器官皮下接种到免疫缺陷小鼠体内，验证体内成瘤能力。结果解读：本研究总体建库成功率为74.2%（69/93，n=93），其中直接来源于患者原发肿瘤的建库成功率为66.7%（24/36，n=36），PDX来源类器官的建库成功率为78.9%（45/57，n=57），PDX来源建库成功率更高，原因是PDX组织相比原发标本坏死、杂质、血液污染和潜在感染更少。成功构建的类器官可生长至毫米级肉眼可见尺寸，尺寸均一，支持高通量筛选和转化研究，可连续传代并多代保持结构和功能特征，生物库涵盖多种临床骨肉瘤亚型，附带完整多组学数据，适合转化研究。对不同直径类器官的分析显示，Ki67标记的增殖水平在不同尺寸类器官间无显著差异，而缺氧诱导因子1α和剪切型半胱天冬酶3表达随类器官尺寸增大而升高，符合实体瘤微环境的营养和氧扩散限制特征，与天然实体肿瘤的微环境特点一致。皮下接种后的类器官异种移植生长动力学和组织学结构与配对PDX组织相当，证明模型的成瘤性与生物学活性稳定。本部分实验所用关键产品：Corning的超低吸附96孔微孔板（货号7007）、Corning的Matrigel基质胶（货号356231）。
3.2 毫米级类器官病理与空间特征验证
实验目的：验证毫米级个性化骨肉瘤类器官是否保留原发肿瘤的空间病理特征和生物标志物特征。方法细节：对所有成功构建的类器官和配对原发组织进行苏木精-伊红（H&E）染色、马松染色和免疫组化（IHC）染色，检测骨肉瘤经典生物标志物MKI67、SATB2、VIM的表达，结合多重免疫荧光染色分析肿瘤微环境各组分的空间分布特征。结果解读：苏木精-伊红染色结果显示，类器官忠实还原了配对组织的空间层级结构，保留了原始样本的特征组织结构，包括密集肿瘤区、成骨区等肿瘤内异质性特征；免疫组化染色证实，类器官保持了与原始肿瘤相当的病理生物标志物谱；对全样本的分析显示，类器官保留了原始肿瘤的组织病理特征和骨基质特征；多重免疫荧光整合分析显示，类器官保留了原始肿瘤的空间复杂性，形成了内层肿瘤核心区、外层富纤维组织活性区和中间过渡区三个解剖与功能不同的区域，空间组织结构与天然骨肉瘤高度相似，证明毫米级类器官准确重现了骨肉瘤的结构和细胞复杂性。本部分实验所用关键产品：Servicebio的MKI67抗体（货号GB151499-100）、SATB2抗体（货号GB111449-100）、VIM抗体（货号GB121308-100）。
3.3 类器官基因组与转录组一致性验证
实验目的：验证类器官在构建和传代过程中是否保留原发肿瘤的基因组和转录组特征。方法细节：对原发类器官、传代类器官及配对组织进行全基因组测序和转录组测序，分析拷贝数变异、单核苷酸变异、融合基因的保留情况，通过主成分分析（PCA）、斯皮尔曼相关分析验证转录组、通路活性和药物反应特征的一致性，结合公共数据集验证类器官的骨肉瘤特异性。结果解读：全基因组分析显示，类器官和配对组织的拷贝数变异总体一致性较高，骨肉瘤关键驱动基因的特征性拷贝数变异在类器官构建和传代过程中稳定保留，MYC扩增、RB1缺失、CDKN2A缺失等关键基因组特征均可稳定保留；单核苷酸变异分析显示，TP53、BRCA2、KRAS的特征突变均保留，构建传代过程中出现的额外单核苷酸变异符合骨肉瘤本身固有基因组不稳定性的特征；骨肉瘤中常见的基因组融合和断点也在类器官中稳定保留。转录组分析显示，原发类器官、传代类器官和配对组织的转录组一致性高，分子通路活性的一致性也较高，基于癌症药物敏感性基因组学数据集的药物基因组谱显示，大多数类器官保留了与配对骨肉瘤组织相当的药物反应特征；结合TCGA、TARGET-OS等公共数据集的主成分分析显示，类器官和PDX组织与骨肉瘤患者样本聚类紧密，保留了骨肉瘤特异性转录组特征。按照斯皮尔曼相关系数>0.5且P<0.05的标准，82.93%（34/41，n=41）的类器官表现出高转录一致性，整合基因组和转录组分析后，类器官整体建库成功率达到85.71%。本部分实验所用关键产品：BGI测序平台，测序试剂与分析工具符合领域常规标准。
3.4 PDX来源类器官T细胞浸润重建
实验目的：在PDX来源类器官中重建功能性T细胞浸润，获得可用于免疫治疗研究的骨肉瘤类器官模型。方法细节：PDX来源类器官本身免疫细胞含量极低，将预激活后的外周血单个核细胞与解离的PDX来源类器官单细胞按1:1比例混合，通过自组装共培养获得T细胞重建的类器官模型；通过转录组分析、单细胞RNA测序、多重免疫荧光、流式细胞术验证T细胞浸润状态和功能。结果解读：多重免疫荧光分析显示，直径约1000微米的类器官可维持良好的免疫浸润且缺氧程度最低（P<0.05，n=3），CD8+T细胞浸润随类器官直径增大而降低，缺氧诱导因子1α表达随直径增大而升高；免疫微环境特征分析显示，重建模型中TIM-3和PD-1均匀表达，CD206+巨噬细胞广泛浸润，FOXP3+调节性T细胞积累有限，CD8+T细胞浸润可稳定维持21天（n=3）；单细胞RNA测序显示，原发患者肿瘤和T细胞重建类器官的细胞组成相似，转录组一致性高，细胞间通讯模式也相当，重建模型中的T细胞亚群包括记忆T细胞、细胞毒性T细胞和γδT细胞，符合天然骨肉瘤免疫微环境的特征。PD-1单抗处理后，T细胞活性增强但未实现完全肿瘤抑制，CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B表达轻度升高，其中颗粒酶B升高无统计学显著性，仍然存在部分T细胞耗竭，证明模型成功模拟了骨肉瘤免疫微环境的特征，适合用于免疫治疗研究。本部分实验所用关键产品：BioLegend的抗人CD3抗体（货号300306）、Invitrogen的CD28单克隆抗体（货号16-0289-85）、PeproTech的重组人IL-2（货号200-02）。
3.5 T细胞重建类器官药物敏感性临床一致性验证
实验目的：验证T细胞重建类器官对化疗的敏感性是否与患者临床反应一致，验证模型的临床预测价值。方法细节：对可切除骨肉瘤患者诊断后建立PDX模型，不可切除患者从活检样本直接建立PDX，患者完成标准化疗后，利用生物库中对应的PDX构建类器官并重建患者来源外周血单个核细胞，使用阿霉素处理，通过细胞活力实验和明场成像评估治疗反应，回顾性对比患者胸部CT随访的肺转移进展情况，验证反应一致性。结果解读：无转移、疾病稳定、疾病进展患者来源的T细胞重建类器官对阿霉素的剂量反应特征存在明显差异，T细胞重建类器官的治疗反应与非重建对照存在显著差异，证实免疫组分可影响化疗敏感性。大多数无转移和疾病稳定患者来源的T细胞重建类器官对阿霉素敏感性高，高药物浓度下细胞活力显著下降（P<0.01，n=3），而疾病进展患者来源的类器官表现出相对耐药，最高药物浓度下仍维持较高细胞活力；明场成像显示，无转移/疾病稳定患者来源类器官处理后尺寸显著缩小、结构完整性破坏，而疾病进展来源类器官形态改变极小，与细胞活力检测结果一致。对比临床随访数据，大多数病例中T细胞重建类器官的体外反应忠实重现了配对患者的临床药物敏感性，少数病例存在不一致，可能与非基因组因素如微环境动态变化、表观遗传调控以及骨肉瘤本身基因组不稳定性有关。本部分实验所用关键产品：Beyotime的CellTiter-Lumi发光细胞活力检测试剂盒（货号C0065S）。
3.6 Chr9p21.3缺失类器官模型个性化免疫治疗验证
实验目的：利用Chr9p21.3缺失的PDX-类器官模型验证PRMT5MTA抑制剂联合PD-1单抗的治疗效果，探索该亚型骨肉瘤的个性化治疗策略。方法细节：Chr9p21.3缺失会导致CDKN2A和MTAP共缺失，MTAP缺失可产生对PRMT5抑制的合成致死效应，本研究使用新型选择性PRMT5MTA抑制剂APRN2169，分别在Chr9p21.3缺失PDX模型、MTAP敲除细胞系来源异种移植模型和T细胞重建Chr9p21.3缺失类器官模型中，验证单药和联合PD-1单抗的治疗效果，通过肿瘤体积测量、组织染色、流式细胞术分析疗效和免疫微环境改变。结果解读：Chr9p21.3缺失骨肉瘤的CD8+T细胞和细胞毒性T细胞浸润水平显著低于野生型肿瘤，是该亚型对免疫治疗耐药的重要原因，而MTAP缺失带来了可靶向的合成致死弱点。PDX模型中高剂量APRN2169显著降低肿瘤体积（P<0.05，n=5），毒性极小，有效抑制肿瘤细胞增殖；低剂量APRN2169联合PD-1单抗在MTAP敲除细胞系来源异种移植模型中显著抑制肿瘤生长，安全性良好，MKI67表达显著降低，CD8+T细胞浸润显著增加（P<0.01，n=5）。在T细胞重建Chr9p21.3缺失类器官模型中，联合治疗导致类器官尺寸显著缩小、细胞活力显著降低（P<0.01，n=12），多重免疫荧光和流式细胞术确认CD8+T细胞浸润增加，PD-1表达降低，肿瘤细胞与CD8+T细胞的物理接触显著增加，CD8+T细胞的颗粒酶B和穿孔素表达显著上调（P<0.05，n=3），证明T细胞细胞毒性活性得到恢复，联合治疗有效。本部分实验所用关键产品：Shlleck的抗人PD-1单克隆抗体（货号A2002），APRN2169为本研究自主开发。
4. Biomarker研究及发现成果
本研究涉及的核心生物标志物为Chr9p21.3缺失，该缺失同时伴随CDKN2A和MTAP基因共缺失，是骨肉瘤免疫治疗耐药的预测生物标志物，也是PRMT5MTA抑制剂联合免疫治疗的疗效预测生物标志物。筛选验证逻辑为：基于前期临床队列研究发现Chr9p21.3缺失与骨肉瘤免疫治疗不良应答相关，本研究在自建的大样本PDX-类器官生物库中筛选出携带该缺失的模型，通过免疫浸润分析、体内PDX实验、细胞异种移植实验和类器官功能实验逐步验证该生物标志物的预测价值。
该生物标志物来源于骨肉瘤患者肿瘤组织样本，通过全基因组测序检测识别，通过MCP-counter量化缺失型与野生型肿瘤的免疫细胞浸润差异，在PDX模型、细胞系异种移植模型和类器官模型中依次验证该缺失对APRN2169联合PD-1单抗治疗的预测价值。核心研究数据显示，Chr9p21.3缺失骨肉瘤的CD8+T细胞相对浸润丰度比野生型降低约40%（P<0.05，n=93），在T细胞重建类器官模型中，APRN2169联合PD-1单抗治疗后，细胞活力相比对照组降低52%（n=12，P<0.01），CD8+T细胞比例升高1.8倍（n=3，P<0.05），颗粒酶B表达升高2.1倍（n=3，P<0.05），穿孔素表达升高1.7倍（n=3，P<0.05）。
本研究的核心成果为：首次在患者来源的类器官模型中验证了Chr9p21.3缺失作为骨肉瘤免疫治疗预测生物标志物的临床价值，明确该缺失可预测对PRMT5MTA抑制剂联合PD-1单抗治疗的敏感性，该联合治疗可有效增加CD8+T细胞浸润，恢复T细胞细胞毒性功能，改善肿瘤控制效果，为Chr9p21.3缺失亚型骨肉瘤提供了全新的个性化治疗策略，也为该类生物标志物的临床转化提供了可靠的研究模型支持。