冷冻电镜揭示了心肌病治疗药物如何调节心脏肌球蛋白马达

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Cryo-EM reveals how cardiomyopathy therapeutic drugs modulate the myosin motors of the heart；

发表期刊：Science Advances；影响因子：13.1（2023年）；研究领域：心血管结构生物学，心肌病药物作用机制研究。

领域共识：β-心肌肌球蛋白是心脏收缩过程中将三磷酸腺苷水解的化学能转化为机械力的核心分子马达，其分子由两个重链、两个必需轻链和两个调节轻链组成六聚体结构。生理状态下，双头肌球蛋白存在两种主要构象：开放态下两个头相互分离可结合肌动蛋白发挥收缩功能，封闭态下两个头相互作用折叠回S2尾部，形成相互作用头基模体（IHM），该构象可显著降低三磷酸腺苷酶活性，是进化上保守的能量节约机制。遗传性心肌病是临床常见的心血管疾病，约30%至40%的肥厚型心肌病（HCM）和3%至4%的扩张型心肌病（DCM）由β-心肌肌球蛋白突变导致。现有研究明确，肥厚型心肌病相关突变通常会破坏IHM的稳定性，增加处于松散松弛态的肌球蛋白头比例，增强肌动蛋白结合能力进而导致心肌过度收缩；而扩张型心肌病相关突变则会稳定IHM结构，减少可结合肌动蛋白的肌球蛋白头进而导致心肌收缩不足。

近年来，直接靶向β-心肌肌球蛋白治疗心肌病的小分子药物研发取得重要突破，其中Mavacamten是获美国食品药品监督管理局批准用于治疗梗阻性肥厚型心肌病的药物，Omecamtiv mecarbil是用于扩张型心肌病治疗的在研激动剂，两种药物对心肌收缩力的调控作用完全相反。既往X射线晶体学对分离的单头肌球蛋白S1片段研究发现，两种药物可结合同一个变构结合口袋，但既往所有结构研究均未针对生理功能状态下的双头IHM构象开展比较分析，而IHM结构中存在单头S1片段不具备的多种分子间相互作用，因此两种药物结合同一位点却产生完全相反功能效应的结构机制始终不明确，无法为下一代精准调控肌球蛋白活性的药物设计提供清晰的结构框架。本研究针对这一核心问题，利用冷冻电镜（cryo-EM）解析不同药物处理下人类β-心肌肌球蛋白IHM的高分辨结构，明确药物调控构象平衡的分子机制，对心肌病药物研发具有重要的学术价值。

2. 文献综述解析

作者对现有研究按照结构基础、致病机制、药物研发三个维度进行梳理分类，首先明确了β-心肌肌球蛋白的分子组装规律，以及IHM构象在能量调控中的核心作用，提出现有研究已经明确不同类型心肌病突变通过改变IHM稳定性影响心肌收缩功能的基本规律，也肯定了靶向β-心肌肌球蛋白小分子药物在心肌病治疗中的应用前景。作者指出现有结构研究的优势在于，X射线晶体学已经明确了两种药物在单头肌球蛋白上的结合位点，证实二者结合同一个变构口袋，为后续研究提供了基础。但现有研究存在明显局限性，一方面所有结构研究均基于分离的单头肌球蛋白S1片段，无法模拟生理状态下双头IHM的分子间相互作用，另一方面既往研究未关注到S2区域的构象异质性，无法解释两种药物结合同一位点产生相反功能的矛盾，也缺乏对药物调控IHM构象平衡的分子机制解析。

基于对现有研究的评述，本研究的创新价值十分明确，本研究是首次在生理状态的双头IHM构象背景下，比较分析两种药物对结构的影响，首次发现IHM中S2区域存在停靠和非停靠两种新的构象，阐明了两种药物通过变构调控构象平衡产生相反功能的分子机制，解决了领域内长期存在的机制疑问，为下一代心肌病治疗药物的设计提供了精确的结构基础。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的研究目标是阐明Mavacamten和Omecamtiv mecarbil两种小分子调控人类β-心肌肌球蛋白IHM构象的结构机制，核心科学问题是结合同一变构口袋的两种小分子如何产生相反的心肌收缩调控效应，整体技术路线为：构建重组双头人类β-心肌肌球蛋白表达载体→蛋白表达纯化后分别制备无药、结合Mavacamten、结合Omecamtiv mecarbil三种样品→冷冻电镜样品制备与数据采集→单颗粒三维重构与构象分类→结构比对与分子间相互作用分析→明确药物调控的分子机制，形成了从结构观察到机制阐释的完整研究闭环。

3.1 重组蛋白与冷冻电镜样品制备

本环节的核心实验目的是获得纯度均一、符合冷冻电镜成像要求的重组人类β-心肌肌球蛋白样品。方法细节方面，本研究构建的重组肌球蛋白分子包含人类β-心肌肌球蛋白重链的1至1016位残基，涵盖两个头部和25个七肽重复的S2区域，C端连接GCN4亮氨酸拉链、短连接肽以及增强绿色荧光蛋白、Avi标签和Flag标签便于纯化。纯化后的野生型蛋白稀释至终浓度1.5μM，药物结合组分别加入50μM Mavacamten或50μM Omecamtiv mecarbil，在25℃条件下孵育15分钟，随后取3微升样品滴加到经等离子体清洗的300目金载网上，在25℃、95%相对湿度条件下吸附4秒，随后快速 plunge冷冻至液态乙烷中，冷冻后的载网储存于液氮中待数据采集。结果解读：本环节成功获得了冰厚度均匀、颗粒分布良好的冷冻电镜样品，满足后续高分辨结构解析的要求。文献未提及具体实验产品，领域常规使用重组蛋白表达纯化试剂、冷冻电镜专用载网与冷冻制样仪器。

3.2 冷冻电镜数据采集与三维重构

本环节的核心实验目的是获得三种条件下不同构象IHM的高分辨三维结构。方法细节方面，首先使用200kV Talos Arctica透射电镜筛选载网，筛选得到的优质载网使用300kV Titan Krios透射电镜采集数据，仪器配备Gatan K3直接电子探测器和Gatan GIF量子能量过滤器，使用SerialEM软件自动采集数据，分别为无药组、Mavacamten组、Omecamtiv mecarbil组采集了10363张、7070张、11894张电影，每张电影分40帧采集，总曝光时间4秒，总电子剂量约51 e−Å−2，散焦范围为-1.0至-2.0μm。数据处理使用cryoSPARC v4.6软件完成，首先进行运动校正和衬度传递函数估计，选择衬度传递函数拟合质量高的显微图像用于后续分析，颗粒拾取采用自动斑点拾取结合Topaz神经网络拾取的策略，去除重复颗粒后经过多轮二维分类去除假阳性和对齐差的颗粒，随后进行从头重构和异质性分类，依据S2和游离头的位置将颗粒分为停靠态和非停靠态两类，分别进行均一和非均匀优化，最终使用金标准傅里叶壳层相关0.143标准计算结构分辨率。结果解读：本环节最终成功获得六种高分辨结构，分别为Mavacamten结合组停靠态3.0Å、非停靠态3.0Å，无药组停靠态3.5Å、非停靠态3.3Å，Omecamtiv mecarbil结合组停靠态4.2Å、非停靠态3.8Å，所有结构均可清晰分辨氨基酸侧链，药物结合组可清晰观察到配体密度，满足原子模型搭建要求。三维分类结果明确显示，三种条件下均存在停靠态和非停靠态两种构象，药物可改变两种构象的比例。

3.3 构象差异与分子间相互作用分析

本环节的核心实验目的是明确两种药物调控IHM构象稳定性的分子机制。方法细节方面，对不同条件不同构象的原子结构进行叠合比对，分别计算S2区域、游离头、封闭头、杠杆臂相对于参考构象的角位移，计算封闭头与游离头界面的埋藏表面积，分析不同构象下S2与头部之间、头部之间的静电相互作用与盐桥形成情况，比较不同药物处理下相互作用的差异。结果解读：构象比例统计显示，在封闭IHM颗粒中，无药条件下停靠态占38%，非停靠态占62%；Mavacamten处理后构象平衡向停靠态偏移，停靠态比例升高至54%（文献未提供具体颗粒数与P值，基于分类统计结果），提示IHM稳定性增强；Omecamtiv mecarbil处理后，封闭IHM中仅20%为停靠态，80%为非停靠态（文献未提供具体颗粒数与P值，基于分类统计结果），提示IHM稳定性显著降低。

结构比对结果显示，从停靠态向非停靠态转变过程中，S2区域的角位移在无药组为19.7°，Mavacamten组为18.6°，Omecamtiv mecarbil组为24.6°，游离头的角位移分别为3.9°、2.7°、3.8°，提示Omecamtiv mecarbil处理后构象变化更大，IHM更不稳定。封闭头与游离头界面的埋藏表面积测量显示，停靠态下Mavacamten组为803Ų，无药组为685Ų，Omecamtiv mecarbil组为548Ų；非停靠态下三组分别为706Ų、627Ų、487Ų（文献未提供统计学显著性，基于结构测量结果），埋藏表面积越小提示界面相互作用越弱，稳定性越低。

相互作用分析显示，S2螺旋上存在两个带负电荷的区域（环1和环2），可分别与封闭头和游离头的Loop2区域带正电荷的残基形成静电相互作用，停靠态下弯曲的S2同时通过环1结合封闭头Loop2、环2结合游离头Loop2，形成桥连结构稳定整个IHM构象，同时还可与封闭台mesa区域的碱性残基形成盐桥进一步增强稳定性；非停靠态下S2伸直，环2与游离头Loop2的相互作用断裂，仅保留环1与封闭头Loop2的相互作用，导致IHM整体稳定性下降。

本研究进一步分析杠杆臂构象发现，Mavacamten结合后可诱导杠杆臂向马达结构域的50kDa上区域发生微小角度旋转，促进K146与D778形成盐桥，限制杠杆臂的灵活性，进而维持S2的停靠构象，增强IHM稳定性；而Omecamtiv mecarbil结合后可诱导杠杆臂发生大幅角度偏移，游离头杠杆臂相对于无药组偏移达13.1°，这种大幅偏移导致S2沿mesa区域滑动接近一个螺旋圈，完全破坏了S2与Loop2之间的静电相互作用网络，最终促进IHM从稳定的停靠态向不稳定的非停靠态转变。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究属于心肌病治疗药物的结构机制研究，研究内容聚焦于蛋白质构象与药物作用机制解析，未开展疾病相关生物标志物（Biomarker）的筛选、验证与功能研究，无相关Biomarker研究成果产出。