炎症性乳腺癌肿瘤和外周血单核细胞中普遍存在的转录增强会影响血浆中的RNA剪接和内含子RNA。
Pervasive enhanced transcription in inflammatory breast cancer tumors and PBMCs impacts RNA splicing and intronic RNAs in plasma
1. 领域背景与文献
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤学，炎性乳腺癌液体活检RNA生物标志物研究。
领域共识：高通量RNA测序是目前疾病RNA生物标志物筛选的核心技术，临床迫切需要可用于微创诊断的血液源性生物标志物。以往血液RNA生物标志物研究大多集中于多聚腺苷酸化信使RNA（mRNA）或成熟微小RNA（miRNA），遗漏了大量可在血液中检测到的长链非编码RNA、小非编码RNA、内含子RNA和重复元件RNA，这类RNA的生物标志物潜力尚未得到充分开发。
炎性乳腺癌是恶性程度最高的乳腺癌亚型，仅占美国乳腺癌病例的2%~4%，却导致8%~10%的乳腺癌死亡，患者中位总生存期仅为5年，其中三阴性炎性乳腺癌预后最差。现有研究显示，全基因组测序未发现炎性乳腺癌与非炎性乳腺癌存在显著的突变特征差异，目前尚无针对炎性乳腺癌的获批靶向疗法，诊断仅依靠临床特征；同时炎性乳腺癌肿瘤多呈小灶性分布，无明确肿块，难以获取高质量活检样本，且疾病罕见样本量受限，因此发现血液源性生物标志物对炎性乳腺癌的诊断和治疗开发极为关键。
现有RNA测序技术多采用逆转录病毒逆转录酶，该酶 inherently保真度和持续合成能力较低，难以高效捕获结构复杂的非编码RNA。当前研究尚未对炎性乳腺癌患者不同样本中的全类型RNA进行全面分析，也未系统探索转录后调控异常在血浆中的反映，缺乏高特异性的炎性乳腺癌血液生物标志物。本研究采用性能更优的耐热II组内含子逆转录酶测序（TGIRT-seq）技术，全面分析炎性乳腺癌患者肿瘤、外周血单个核细胞和血浆的RNA表达特征，筛选潜在微创诊断生物标志物，填补了该领域的研究空白。
2. 文献综述解析
作者从技术发展和疾病研究两个维度梳理了现有研究进展。在技术层面，作者指出现有基于逆转录病毒逆转录酶的RNA测序方法存在固有局限，无法高效捕获结构复杂、高度修饰的非编码RNA，而近年来研究发现，II组内含子逆转录酶在保真度、持续合成能力和链置换活性上均优于逆转录病毒逆转录酶，作者团队前期基于该酶开发了TGIRT-seq技术，可实现编码和非编码RNA的全面捕获，包括血浆和胞外囊泡中的低丰度RNA，但该技术尚未应用于炎性乳腺癌的全RNA谱分析。
在疾病研究层面，作者指出现有炎性乳腺癌研究多聚焦于基因突变和成熟mRNA表达分析，全基因组测序结果显示炎性乳腺癌与非炎性乳腺癌的大多数癌症相关基因突变频率相似，无显著区分特征；部分研究报道了少量炎性乳腺癌相关差异表达RNA，但样本量有限，且未关注内含子RNA、重复元件RNA等非编码RNA的表达变化，也未系统分析转录后调控异常，无法满足血液生物标志物开发的需求。现有研究的核心局限性包括三点：一是测序方法限制导致非编码RNA和内含子RNA信息缺失；二是仅检测外显子成熟mRNA，无法反映RNA剪接等转录后调控异常；三是缺乏对血浆全类型RNA的系统分析，难以筛选得到高特异性的微创诊断生物标志物。
相比于现有研究，本研究的创新价值十分明确：首次将TGIRT-seq技术应用于炎性乳腺癌研究，同时分析肿瘤、外周血单个核细胞、血浆三种样本的全类型RNA，开发了内含子-外显子深度比参数同时分析转录和转录后调控，首次发现炎性乳腺癌存在普遍增强转录导致RNA剪接饱和的特征，明确了炎性乳腺癌血浆富集内含子RNA的核心特征，筛选得到多个高特异性的潜在血浆生物标志物，为炎性乳腺癌的微创诊断提供了新候选靶点，也为其他疾病的血液RNA生物标志物研究提供了方法学参考。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体研究目标为全面解析炎性乳腺癌不同样本的RNA表达与转录后调控特征，筛选可用于微创诊断的血浆RNA生物标志物；核心科学问题为炎性乳腺癌是否存在普遍性转录异常与RNA剪接改变，这些改变是否可反映在血浆中并作为诊断生物标志物；技术路线为：临床样本收集→TGIRT-seq建库测序→生物信息学分析差异表达与内含子保留特征→分析不同样本间RNA表达的相关性→筛选炎性乳腺癌特异性血浆生物标志物，形成了从特征发现到候选筛选的完整研究闭环。
3.1 临床样本收集与RNA预处理
实验目的：收集符合研究要求的炎性乳腺癌、非炎性乳腺癌患者及健康供者样本，制备合格的RNA用于测序。方法细节：研究共纳入10例炎性乳腺癌患者的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤切片、外周血单个核细胞、血浆样本，6例非炎性乳腺癌患者的对应样本，13例健康女性供者的外周血单个核细胞和血浆样本，另外购买了4例非炎性乳腺癌患者的配对冻存正常乳腺组织RNA，所有炎性乳腺癌样本均经病理医生复核诊断，确认肿瘤细胞占比大于60%；细胞RNA采用去核糖体RNA处理后，按200核苷酸分界分离长、短片段RNA，长片段RNA经化学片段化后与短片段RNA混合，血浆RNA不进行去核糖体RNA和大小选择，所有RNA均经过核酸酶处理去除残留DNA，后续清洁回收后用于建库。实验所用关键产品：Thermo Fisher的磷酸盐缓冲液、GE Healthcare的Ficoll-Paque PLUS、QIAGEN的miRNeasy Serum/Plasma Advanced试剂盒、Zymo的RNA清洁浓缩试剂盒、New England Biolabs的NEBNext镁离子RNA片段化模块、Lucigen的Baseline-ZERO脱氧核糖核酸酶。结果解读：所有样本RNA质量符合测序要求，不同福尔马林固定石蜡包埋肿瘤样本的RNA损伤水平一致，不会导致后续差异表达分析的偏差（文献未明确提供具体质检数据，基于方法学描述推测）。
3.2 TGIRT-seq建库测序与生物信息学比对
实验目的：构建测序文库并获得高质量的比对数据，分析不同样本的RNA生物类型分布特征。方法细节：采用TGIRT模板切换法添加3"测序接头，连接添加5"测序接头后PCR扩增，在Illumina NextSeq平台进行双端测序；采用分步比对策略依次比对线粒体基因组、大肠杆菌基因组、小非编码RNA、核糖体RNA，最后比对人类GRCh38参考基因组，统计不同基因组特征的reads计数。结果解读：主成分分析显示样本类型是RNA序列差异的主要来源，所有类型的RNA生物包括重复元件RNA，都含有足够的差异表达RNA可以区分炎性乳腺癌与对照样本，仅小非编码RNA在福尔马林固定石蜡包埋肿瘤样本中的区分度较低；图1的堆叠柱状图显示，蛋白质编码基因reads占乳腺组织和外周血单个核细胞总reads的31%~80%，在血浆中仅占3.0%~40.6%，转运RNA、小非编码RNA、重复元件RNA在血浆中占比更高且变异更大；炎性乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋肿瘤和外周血单个核细胞中，转运RNA相对其他RNA类型的表达显著高于非炎性乳腺癌（n=10 IBC，n=6 non-IBC，P<0.05），支持炎性乳腺癌外周血单个核细胞存在更高水平的激活。
3.3 差异表达分析与内含子-外显子深度比分析
实验目的：分析炎性乳腺癌与对照组的差异表达基因，开发参数量化内含子保留频率，反映RNA剪接效率。方法细节：采用DESeq2进行基因水平差异表达分析，基于比对到基因组（外显子+内含子）和转录组（仅外显子）的reads，开发内含子-外显子深度比（IDR）参数，计算每个基因的内含子保留频率；根据内含子和外显子的覆盖深度差异，将蛋白质编码基因分为I~IV型，其中IV型为反义链占比≥30%的基因，I型为外显子覆盖显著高于内含子，III型为内含子覆盖显著高于外显子，再根据覆盖偏度分为IIIa、IIIb、IIIc三个亚型。结果解读：图2A显示，炎性乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋肿瘤样本中，所有基因的平均IDR约为0.19，即内含子区域平均读深约为外显子的19%，但大量基因IDR≥0.5，说明存在较高水平的内含子RNA积累；upset图显示，炎性乳腺癌肿瘤、患者外周血单个核细胞都存在大量IDR在0.5~1.0及≥1.0的基因，提示广泛存在RNA剪接速率受限，导致未剪接前体mRNA积累。
3.4 肿瘤与外周血单个核细胞差异表达分析
实验目的：分别明确炎性乳腺癌肿瘤和外周血单个核细胞的差异表达特征。方法细节：以校正后P≤0.001、log2倍数变化绝对值≥2为阈值，分别筛选肿瘤和外周血单个核细胞中的显著差异表达基因，采用GO-MWU分析Hallmark基因集的富集情况，采用CIBERSORTx分析外周血单个核细胞的细胞组成差异。结果解读：在福尔马林固定石蜡包埋肿瘤对比中，共鉴定出43个显著差异表达基因，其中28个蛋白质编码基因、15个非编码RNA，肿瘤坏死因子α通过核因子κB信号通路、上皮间质转化是最显著富集的上调基因集，JUN、FOS等核心通路基因显著上调，这些基因是激活蛋白1的组成部分，参与恶性肿瘤的高转录和炎症促进进展；图3展示了显著差异表达基因的热图。
在外周血单个核细胞对比中，共鉴定出374个显著差异表达基因（校正后P≤0.001，|log2倍数变化|≥2，n=10 IBC），肿瘤坏死因子α通过核因子κB、炎症反应等5个Hallmark基因集显著富集上调；CIBERSORTx分析显示，炎性乳腺癌患者外周血单个核细胞中活化树突状细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平显著高于健康供者和非炎性乳腺癌患者（n=10 IBC，P<0.05），静息肥大细胞水平显著降低；仅5个基因在基因组和转录组两种比对方式下都显著上调，378个基因仅在基因组比对（包含内含子）中显著上调，提示炎性乳腺癌患者外周血单个核细胞中广泛存在速率受限的RNA剪接，仅检测外显子的测序方法会遗漏大量信息。图4和图5分别展示了外周血单个核细胞差异基因热图和富集分析结果。
3.5 血浆差异RNA分析与来源验证
实验目的：筛选炎性乳腺癌血浆中特异性的差异RNA，验证其细胞来源。方法细节：采用DESeq2和MACS2峰 Calling两种方法筛选差异RNA，分析血浆RNA与肿瘤、外周血单个核细胞RNA的相关性，通过整合基因组视图比对验证差异RNA的来源。结果解读：DESeq2分析共得到76个显著过表达RNA（校正后P≤0.001，log2倍数变化≥2，n=10 IBC），其中30个蛋白质编码基因RNA、6个长链非编码RNA、1个小非编码RNA、39个重复元件RNA，峰 Calling额外得到68个候选差异片段，大部分为重复元件RNA；最关键的发现是，炎性乳腺癌血浆中过表达的蛋白质编码基因RNA中，内含子RNA占总碱基的比例超过91%，而健康供者和非炎性乳腺癌血浆中该比例仅为10%和6%，差异极其显著；相关性分析显示，血浆中内含子RNA的富集水平与肿瘤、外周血单个核细胞中高IDR基因的表达水平显著正相关，说明血浆内含子RNA直接来源于肿瘤和外周血单个核细胞的转录剪接异常；TRBJ1-1、TRBJ1-2、TRBJ1-6三个外显子-内含子连接区RNA片段在炎性乳腺癌血浆中特异性富集，其中TRBJ1-6在所有10例炎性乳腺癌血浆中都能检测到，在所有健康和非炎性乳腺癌血浆中都未检测到，该片段同时存在于炎性乳腺癌肿瘤和外周血单个核细胞中，是非常有潜力的诊断生物标志物；重复元件分析显示，长散布核元件LINE-1等逆转录元件在炎性乳腺癌肿瘤、外周血单个核细胞和血浆中普遍过表达，L1Hs正义链RNA表达显著高于非炎性乳腺癌，血浆中L1Hs富集更明显，反义链比例更高。图6、图7、图9、图10分别展示了血浆差异分析和重复元件分析的结果。
推测：LINE-1激活是炎性乳腺癌普遍高转录的特征之一，可能通过激活邻近基因、激活天然免疫通路促进炎症反应和肿瘤进展。
4. Biomarker研究及发现成果
本研究涉及的生物标志物均为血浆RNA生物标志物，主要包括三类：TRBJ1基因外显子-内含子连接区RNA片段、内含子RNA片段、逆转录重复元件RNA；筛选逻辑为：通过TGIRT-seq全面分析炎性乳腺癌患者肿瘤、外周血单个核细胞、血浆三组样本的全类型RNA差异→筛选仅在炎性乳腺癌血浆中特异性富集的RNA→通过序列比对验证其来源于肿瘤和外周血单个核细胞的转录异常，最终得到候选生物标志物。
研究过程中，生物标志物均来源于临床炎性乳腺癌患者的血浆样本，研究共纳入10例炎性乳腺癌、6例非炎性乳腺癌、13例健康供者的血浆样本，通过TGIRT-seq测序定量不同RNA的表达，以校正后P≤0.001、log2倍数变化≥2为筛选标准，得到多个高特异性候选；最突出的候选TRBJ1-6 RNA片段，在10例炎性乳腺癌血浆中全部检出，在19例对照血浆（13例健康+6例非炎性）中全部未检出，特异性达到100%（n=10 IBC，n=19 对照）；另外，多个内含子RNA片段如PHF24、PLVAP内含子片段仅在炎性乳腺癌血浆中高度富集，ATP2B1基因在所有炎性乳腺癌肿瘤和外周血单个核细胞中均显著过表达，LINE-1等重复元件RNA在炎性乳腺癌血浆中也显著过表达。
本研究的核心成果包括：首次明确炎性乳腺癌肿瘤和外周血单个核细胞存在普遍增强转录，该特征导致RNA剪接机器饱和，发生速率受限的RNA剪接，大量未剪接的内含子RNA释放进入血浆，因此炎性乳腺癌血浆以富集内含子RNA为核心特征，而健康和非炎性乳腺癌血浆以富集外显子mRNA片段为特征；筛选得到的TRBJ1-6 RNA片段对炎性乳腺癌具有极高的诊断特异性，是非常有前景的微创诊断生物标志物；ATP2B1基因在炎性乳腺癌肿瘤和外周血单个核中均显著过表达（校正后P<10^-8，log2倍数变化>1.5，n=10 IBC，n=6 non-IBC），也是潜在的诊断生物标志物；LINE-1等逆转录元件在炎性乳腺癌中普遍激活，其RNA片段可作为辅助诊断的生物标志物。本研究不仅为炎性乳腺癌提供了多个新的诊断候选靶点，也为其他疾病的血液RNA生物标志物研究提供了方法学参考，提示同时分析内含子和外显子信息可发现更多被传统方法遗漏的关键调控特征。