KLF7/VPS35 axis contributes to hepatocellular carcinoma progression through CCDC85C-activated β-catenin pathway.

1. 领域背景与文献引入

文献英文标题：KLF7/VPS35 axis contributes to hepatocellular carcinoma progression through CCDC85C-activated β-catenin pathway；发表期刊：Cell & Bioscience；影响因子：7.13（2021年）；研究领域：肿瘤学-肝细胞癌分子机制

领域共识：肝细胞癌是全球发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，其发生发展涉及多基因、多信号通路的异常调控，晚期患者缺乏有效的治疗手段，寻找新的驱动分子和靶向治疗靶点是当前肝癌研究的核心方向之一。Krüppel样因子（KLF）家族作为一类保守的锌指转录因子，已被证实参与多种肿瘤的发生发展，其中KLF7在神经发育及非小细胞肺癌、胃癌等实体瘤中发挥促癌作用，但目前关于KLF7在肝细胞癌中的作用及分子机制尚未见报道。空泡蛋白分选相关蛋白35（VPS35）作为retromer复合物的核心组分，此前研究发现其在肝细胞癌中高表达并通过PI3K/AKT通路促进肿瘤进展，但上游调控机制仍不明确。卷曲螺旋结构域蛋白85C（CCDC85C）此前仅在脑积水及犬乳腺肿瘤中有少量研究，其与肝细胞癌的相关性完全未知。针对上述研究空白，本研究旨在系统探究KLF7在肝细胞癌中的功能，并解析其通过调控VPS35/CCDC85C/β-连环蛋白通路促进肿瘤进展的分子机制，为肝细胞癌的诊断和治疗提供新的潜在靶点。

2. 文献综述解析

本文献综述部分按分子类型（KLF7、VPS35、CCDC85C）的维度对领域内现有研究进行分类梳理，明确了各分子的研究现状与未解决问题。

现有研究中，KLF家族成员广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及周期调控等生物学过程，KLF7作为该家族成员，已被证实参与神经元形态发生，并在非小细胞肺癌、胃癌等实体瘤中发挥促癌作用，但缺乏其在肝细胞癌中的功能研究；VPS35主要参与内体到高尔基体或细胞膜的蛋白分选过程，此前研究发现其在肝细胞癌中作为癌基因激活PI3K/AKT通路促进肿瘤生长，但上游转录调控机制尚未阐明；CCDC85C仅在小鼠脑积水模型及犬乳腺肿瘤中有少量报道，其在肝细胞癌中的表达及功能完全未知。现有研究的局限性在于未揭示KLF7与肝细胞癌的关联，也未明确VPS35在肝细胞癌中的上游调控分子，同时缺乏CCDC85C与肝细胞癌的相关研究。

本研究的创新价值在于首次揭示了KLF7作为转录因子在肝细胞癌中高表达，并通过直接结合VPS35的启动子区域激活其转录表达，进而通过与CCDC85C相互作用激活β-连环蛋白信号通路，完善了肝细胞癌中该信号轴的调控网络；同时首次将CCDC85C与肝细胞癌的发生发展关联起来，填补了KLF7在肝细胞癌功能及VPS35上游调控机制的研究空白，为肝细胞癌的分子靶向治疗提供了新的潜在靶点。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的核心目标是明确KLF7在肝细胞癌中的功能及分子调控机制，核心科学问题为KLF7如何通过下游信号通路调控肝细胞癌的增殖、侵袭等恶性生物学行为，技术路线遵循“临床样本初筛→细胞功能验证→动物实验验证→分子机制解析→临床样本验证”的闭环逻辑，从临床到基础再回到临床，系统解析了KLF7/VPS35/CCDC85C/β-连环蛋白轴在肝细胞癌中的作用。

3.1 临床样本中KLF7的表达及临床相关性分析

本环节的实验目的是明确KLF7在肝细胞癌患者临床样本中的表达水平，及其与患者临床病理特征的相关性。方法细节上，研究团队收集了20对肝细胞癌及癌旁正常组织样本，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测KLF7的mRNA表达水平；同时使用包含50例肝细胞癌组织和20例正常肝组织的组织芯片进行免疫组化（IHC）染色，检测KLF7的蛋白表达；此外从TCGA数据库中提取肝细胞癌患者的基因表达及生存数据，分析KLF7表达与患者生存的相关性。结果解读显示，qRT-PCR结果表明肝细胞癌组织中KLF7的mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织（n=20，P=0.001）；有转移的肝细胞癌组织中KLF7表达水平显著高于无转移组（n=20，P=0.0072），低分化肝细胞癌组织中KLF7表达水平显著高于高分化组（n=20，P=0.0259）；免疫组化染色结果显示，肝细胞癌组织中KLF7呈强阳性表达，而正常肝组织中表达水平较低；但TCGA数据库分析显示，KLF7高表达与肝细胞癌患者的总生存无显著相关性（n=90，P=0.28）。实验所用关键产品：抗KLF7抗体（货号398576，Santa Cruz）；qRT-PCR试剂、免疫组化染色试剂未明确品牌，领域常规使用Takara qRT-PCR试剂盒、Dako免疫组化试剂盒等。

3.2 KLF7在肝癌细胞及动物模型中的功能验证

本环节的实验目的是验证KLF7对肝细胞癌细胞增殖、侵袭、细胞周期及凋亡的调控作用，以及其在体内的成瘤能力。方法细节上，在Huh-7和SKHEP1肝细胞癌细胞系中，采用siRNA技术敲低KLF7的表达，或通过pcDNA3.1质粒过表达KLF7；分别采用CCK-8实验检测细胞增殖能力，克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，Transwell实验检测细胞侵袭能力，流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率；同时构建裸鼠皮下移植瘤模型，将稳定敲低或过表达KLF7的MHCC97H细胞分别注射到裸鼠右侧颈部，每3天测量肿瘤大小，30天后处死小鼠并计算肿瘤体积和重量。结果解读显示，敲低KLF7后，Huh-7和SKHEP1细胞的增殖能力显著降低（n=3，P<0.01），克隆形成率显著下降（n=3，P<0.01），细胞侵袭能力显著减弱（n=3，P<0.01），G0/G1期细胞比例显著增加，凋亡率显著升高（n=3，P<0.05）；过表达KLF7则显著促进肝细胞癌细胞的增殖、侵袭能力，加速细胞周期进程，抑制细胞凋亡（n=3，P<0.01）；体内实验结果显示，KLF7敲低组的肿瘤体积和重量显著小于对照组（n=5，P<0.01），KLF7过表达组的肿瘤体积和重量显著大于对照组（n=5，P<0.001），与体外实验结果一致。实验所用关键产品：FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）、Transwell小室（Corning lnc., USA）；CCK-8试剂盒未明确品牌，领域常规使用Dojindo CCK-8试剂盒。

3.3 KLF7调控VPS35的分子机制验证

本环节的实验目的是明确KLF7是否通过转录激活VPS35的表达来发挥促癌作用。方法细节上，采用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测KLF7敲低或过表达后VPS35的蛋白表达水平；通过TCGA数据库分析KLF7与VPS35在肝细胞癌组织中的表达相关性；采用双荧光素酶报告基因实验，将VPS35的启动子序列克隆到荧光素酶报告载体中，与KLF7过表达载体共转染肝细胞癌细胞，检测荧光素酶活性；采用染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）实验验证KLF7与VPS35启动子的结合；通过rescue实验，在KLF7过表达的细胞中敲低VPS35，检测细胞增殖和侵袭能力的变化。结果解读显示，KLF7敲低后VPS35的蛋白表达水平显著降低，过表达KLF7则显著升高VPS35的蛋白表达；TCGA数据库分析显示，KLF7与VPS35在肝细胞癌组织中的表达呈显著正相关；双荧光素酶报告基因实验显示，KLF7过表达显著增强VPS35启动子的荧光素酶活性（n=3，P<0.01）；ChIP-qPCR实验证实KLF7可直接结合VPS35的启动子区域；rescue实验显示，敲低VPS35可显著逆转KLF7过表达对肝细胞癌细胞增殖和侵袭的促进作用（n=3，P<0.01）。实验所用关键产品：抗VPS35抗体（货号157220，Abcam）、双荧光素酶报告基因检测系统（Promega, USA）、SimpleChIP酶促染色质IP试剂盒（Cell Signaling）。

3.4 VPS35与CCDC85C的相互作用及对β-连环蛋白通路的调控

本环节的实验目的是探究VPS35下游的互作分子及KLF7/VPS35轴调控的下游信号通路。方法细节上，采用免疫共沉淀（Co-IP）实验结合质谱分析筛选VPS35的互作分子，并通过Western blot验证VPS35与CCDC85C的相互作用；通过TCGA数据库分析CCDC85C在肝细胞癌组织中的表达及与患者生存的相关性；通过rescue实验，在VPS35过表达的细胞中敲低CCDC85C，检测细胞增殖、侵袭及凋亡能力的变化；采用Western blot检测KLF7/VPS35轴对β-连环蛋白通路的影响，并使用β-连环蛋白抑制剂GK974处理细胞，验证通路功能。结果解读显示，Co-IP实验结合质谱分析证实VPS35与CCDC85C在肝细胞癌细胞中存在相互作用；TCGA数据库分析显示，CCDC85C在肝细胞癌组织中高表达，与患者总生存不良（P=0.036）及无病生存不良（P<0.027）显著相关；rescue实验显示，敲低CCDC85C可显著逆转VPS35过表达对肝细胞癌细胞增殖和侵袭的促进作用（n=3，P<0.01）；Western blot结果显示，KLF7/VPS35轴可显著上调活性β-连环蛋白的表达，β-连环蛋白抑制剂GK974可显著阻断VPS35过表达对肝细胞癌细胞增殖的促进作用（n=3，P<0.001）；免疫组化染色显示，肝细胞癌组织中VPS35与活性β-连环蛋白的表达呈显著正相关（n=50，P<0.05）。实验所用关键产品：抗CCDC85C抗体（货号TA330857，ORIGENE）、抗活性β-连环蛋白抗体（货号19807，Cell Signaling Technology）；β-连环蛋白抑制剂GK974未明确品牌，领域常规使用Selleck GK974。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究涉及的Biomarker包括KLF7、VPS35、CCDC85C及活性β-连环蛋白，筛选与验证逻辑遵循“临床样本初筛表达差异→细胞/动物实验验证功能→分子机制解析→临床样本验证相关性”的完整链条，系统解析了各分子作为肝细胞癌Biomarker的潜力。

研究过程中，KLF7的检测来源于20对肝细胞癌及癌旁组织样本、50例肝细胞癌组织芯片，通过qRT-PCR和免疫组化检测其表达，结果显示KLF7在肝细胞癌组织中高表达，与患者的分化程度和转移状态显著相关（n=20，P=0.001、0.0072、0.0259）；VPS35通过Western blot、TCGA数据库及免疫组化检测，显示其在肝细胞癌组织中高表达，与KLF7和活性β-连环蛋白的表达呈正相关，且高表达提示患者不良生存（TCGA数据库，P<0.05）；CCDC85C通过TCGA数据库分析显示其在肝细胞癌组织中高表达，与患者总生存和无病生存不良显著相关（P=0.036、P<0.027）；活性β-连环蛋白通过免疫组化检测显示其在肝细胞癌组织中高表达，与KLF7、VPS35的表达呈正相关（n=50，P<0.05）。

核心成果方面，KLF7作为转录因子，通过激活VPS35的转录表达，进而与CCDC85C相互作用激活β-连环蛋白通路，促进肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和体内成瘤，是肝细胞癌的驱动分子；KLF7、VPS35、CCDC85C均可作为肝细胞癌潜在的诊断Biomarker，其中VPS35和CCDC85C可作为潜在的预后Biomarker，VPS35高表达提示患者不良生存，CCDC85C高表达与患者总生存和无病生存不良相关；KLF7/VPS35/CCDC85C/β-连环蛋白轴可作为肝细胞癌治疗的潜在靶点，β-连环蛋白抑制剂可有效阻断该信号轴的促肿瘤作用，为肝细胞癌的靶向治疗提供了新的方向。