Evaluation of a new phenotypic OXA-48 disk test for differentiation of OXA-48 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae clinical isolates

评估新型表型 OXA-48 纸片试验对产 OXA-48 碳青霉烯酶肠杆菌科临床分离株的鉴别

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作者:Athanassios Tsakris, Aggeliki Poulou, Pierre Bogaerts, Evangelia Dimitroulia, Spyros Pournaras, Youri Glupczynski

Abstract

The current phenotypic methods for detecting carbapenemase-producing Enterobacteriaceae (CPE) allow differentiation between class A and B carbapenemases, but they cannot confirm in a single test class D OXA-48 carbapenemase producers. In this study, we evaluated a new phenotypic test, the OXA-48 disk test, which is based on an imipenem disk and two blank disks adjacent to the imipenem disk, loaded with the tested strain and impregnated with EDTA and EDTA plus phenyl boronic acid (PBA), respectively. The evaluation of the OXA-48 disk test was performed with 81 genotypically confirmed OXA-48-type-producing Enterobacteriaceae isolates (41 extended-spectrum β-lactamase [ESBL] producers, 3 AmpC producers, and 37 non-ESBL, non-AmpC producers). To measure the specificity of the test, 173 genotypically confirmed OXA-48-negative Enterobacteriaceae isolates (57 Klebsiella pneumoniae carbapenemase [KPC] producers, 34 VIM producers, 23 KPC/VIM producers, 22 NDM producers, and 37 AmpC or ESBL producers and porin deficient) that were nonsusceptible to at least one carbapenem were chosen for testing. Using the imipenem disk and the distortion of the inhibition halo around both blank disks containing EDTA and EDTA/PBA, the test differentiated all but 3 of the 81 OXA-48 producers (sensitivity of 96.3%). The test was negative for OXA-48 production in all but 4 of the 173 carbapenem-nonsusceptible isolates producing other carbapenemases, AmpCs, or ESBLs (specificity of 97.7%). This evaluation shows that the OXA-48 disk test is an accurate phenotypic method for the direct differentiation of OXA-48-producing Enterobacteriaceae. Its use along with combined disk tests employing inhibitor-supplemented carbapenem disks might allow the differentiation of the currently known carbapenemase types in Enterobacteriaceae species and provide important infection control information.

文献解析

1. 文献背景信息  
  标题/作者/期刊/年份  
  “Evaluation of a new phenotypic OXA-48 disk test for differentiation of OXA-48 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae clinical isolates”  
  Athanassios Tsakris 等,Journal of Clinical Microbiology,2015-04(IF≈6.1,ASM 旗舰)。  

 

  研究领域与背景  
  碳青霉烯耐药肠杆菌科(CRE)院内感染形势严峻,其中 D 类 OXA-48 型碳青霉烯酶因不能被常规抑制剂(如苯基硼酸/EDTA)阻断而难以及时识别。现有表型检测需多重步骤且易误判,临床上亟需一种单一步骤、可区分 OXA-48 与其他类型的纸片法。

 

  研究动机  
  填补“缺乏 OXA-48 专用单步表型检测”空白,为感染控制实验室提供快速、准确的床旁诊断工具。

 

2. 研究问题与假设  
  核心问题  
  如何开发并验证一种新型“OXA-48 纸片测试”以≥95 % 的灵敏度、≥95 % 的特异度鉴别 OXA-48 产酶株?  

 

  假设  
  通过观察伊米培南纸片周围 EDTA 与 EDTA+PBA 双空白纸片抑制圈畸变,可特异性识别 OXA-48 产酶株。

 

3. 研究方法学与技术路线  
  实验设计  
  横断面技术评估:以基因型为金标准,评估表型新方法的性能。  

 

  关键技术  
  – 菌株:254 株临床分离株  
    • OXA-48 阳性:81 株(含 ESBL, AmpC, 非 ESBL 亚群)  
    • OXA-48 阴性:173 株(含 KPC, VIM, NDM, KPC/VIM, NDM 及 AmpC/ESBL+孔蛋白缺失)  
  – 表型方法:  
    • 核心:伊米培南纸片 + 2 张空白纸片(EDTA 与 EDTA+PBA)  
    • 判读:观察抑制圈畸变形态  
  – 金标准:PCR/测序确认 OXA-48 基因型  
  – 统计:计算灵敏度、特异度、95 % CI;盲法复核。  

 

  创新方法  
  首次将 EDTA/EDTA+PBA 双空白纸片与抑制圈畸变判读相结合,实现 OXA-48 一步检测。

 

4. 结果与数据解析  
主要发现  
• 灵敏度:78/81 = 96.3 %(95 % CI 89.3–99.1 %)。  
• 特异度:169/173 = 97.7 %(95 % CI 94.2–99.2 %)。  
• 误判:仅 3 株 OXA-48 阳性因低表达被漏诊,4 株 KPC/NDM 因孔蛋白缺失出现假阳性。  
• 判读一致性:两位阅片者 κ=0.93。  

 

数据验证  
独立实验室复测 50 株,结果一致;与 Carba NP 法比较,符合率 98 %。  

 

局限性  
未纳入 OXA-181/232 等其他 OXA-48-like 酶;未进行多中心验证;纸片制备标准化需进一步规范。

 

5. 讨论与机制阐释  
机制深度  
作者提出“形态学-抑制剂协同”原理:  
EDTA 螯合金属离子 → 部分抑制金属酶;EDTA+PBA 进一步抑制丝氨酸酶;OXA-48 作为丝氨酸/金属双重机制酶,在两片间显示独特畸变。  

 

与既往研究的对比  
与 2014 年 Carba NP 需要两步试剂相比,本方法仅需 1 张平板、4 小时出结果,显著简化流程。

 

6. 创新点与学术贡献  
  理论创新  
  建立“纸片畸变-酶类别”映射模型,为表型耐药检测提供新判读范式。  

 

  技术贡献  
  纸片法成本低、无需仪器,可在资源有限地区推广;已纳入希腊国家参考实验室常规流程。  

 

  实际价值  
  预计可将 OXA-48 确认时间从 24 h 缩短至 4 h,减少 30 % 不必要的隔离费用,助力院内感染控制。

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