Abstract
Russian Annexins as Ca2+/phospholipid-binding proteins are involved in the control of many biological processes essential for plant growth and development. In a previous study, we had shown, using a proteomic approach, that the synthesis of two annexins is induced in pea roots in response to rhizobial inoculation. In this study, phylogenetic analysis identif ied these annexins as PsAnn4 and PsAnn8 based on their homology with annexins from other legumes. The modeling approach allowed us to estimate the structural features of these annexins that might inf luence their functional activity. To verify the functions of these annexins, we performed comparative proteomic analysis, experiments with calcium inf lux inhibitors, and localization of labeled proteins. Essential down-regulation of PsAnn4 synthesis in a non-nodulating pea mutant P56 (sym10) suggests an involvement of this annexin in the rhizobial symbiosis. Quantitative RT-PCR analysis showed that PsAnn4 was upregulated at the early stages of symbiosis development, starting from 1-3 days after inoculation to up to 5 days after inoculation, while experiments with the Ca2+ channel blocker LaCl3 revealed its negative inf luence on this expression. To follow the PsAnn4 protein localization in plant cells, it was fused to the f luorophores such as red f luorescent protein (RFP) and yellow f luorescent protein (YFP) and expressed under the transcriptional regulation of the 35S promoter in Nicotiana benthamiana leaves by inf iltration with Agrobacterium tumefaciens. The localization of PsAnn4 in the cell wall or plasma membrane of plant cells may indicate its participation in membrane modif ication or ion transport. Our results suggest that PsAnn4 may play an important role during the early stages of pea-rhizobial symbiosis development. Аннексины являются Ca2+/фосфолипид-связывающими белками, которые вовлечены в контроль многих биологических процессов, необходимых для роста и развития растений. Ранее выполненный протеомный анализ позволил нам выявить два аннексина, синтез которых усиливается в ответ на ризобиальную инокуляцию. В этой работе с помощью филогенетического анализа два аннексина были классифицированы как PsAnn4 и PsAnn8 на основании их гомологии с аннексинами других бобовых растений. С помощью молекулярного моделирования мы изучили структурные особенности этих аннексинов, которые могут влиять на их функциональную активность. Для анализа функции PsAnn4 и PsAnn8 были проведены сравнительный протеомный анализ, эксперименты с ингибиторами поступления кальция в клетку и локализация в тканях растений. Отсутствие активации синтеза PsAnn4 у мутанта гороха P56 (sym10), не способного формировать клубеньки, предполагает участие этого аннексина в бобово-ризобиальном симбиозе. Количественная ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией, показала, что экспрессия гена PsAnn4 увеличивается на ранних стадиях развития симбиоза начиная с 1–3-го дня после инокуляции до 5-го дня, тогда как блокатор Ca2+ канала LaCl3 подавляет эту экспрессию. Для изучения локализации PsAnn4 в клетках растений были получены конструкции для синтеза этого белка, слитого с такими флуорофорами, как красный флуоресцентный белок (RFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP) при транскрипционной регуляции под промотором 35S в листьях Nicotiana benthamiana при инфильтрации Agrobacterium tumefaciens. Локализация PsAnn4 в клеточной стенке или плазматической мембране клеток растений указывает на возможность участия этого аннексина в ионном транспорте или модификации мембраны. Обсуждается возможная роль аннексина PsAnn4 в регуля- ции ранних стадий развития симбиоза у гороха.