Abstract
Russian The genus Xanthomonas comprises phytopathogenic bacteria which infect about 400 host species, including a wide variety of economically important plants. Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang et al., 1957) Swings et al., 1990 is the causal agent of bacterial leaf streak (BLS) being one of the most destructive bacterial diseases of rice. BLS symptoms are very similar to those of bacterial blight caused by closely related Xanthomonas oryzae pv. oryzae. X. o. pv. oryzae and X. o. pv. oryzicola and often occur in rice f ields simultaneously, so separate leaves may show symptoms of both diseases. The quarantine status and high severity of the pathogen require a highly eff icient, fast and precise diagnostic method. We have developed an assay for Xanthomonas oryzae pv. oryzicola detection using real-time polymerase chain reaction (qPCR) and PCR amplicon sequencing. The DNA samples of X. o. pv. oryzae and X. o. pv. oryzicola were obtained from the collection of CIRM-CFBR (France). To evaluate the analytical sensitivity of the assay, a vector construct based on the pAL2-T plasmid was created through the insertion of X. o. pv. oryzicola target fragment (290 bp). Primers and a probe for qPCR were selected for the hpa1 gene site. They allowed identifying all the strains the sequences of which had been loaded in the GenBank NCBI Nucleotide database before November 11, 2021. The SeqX.o.all sequencing primers were selected for the hrp gene cluster sequence, namely for the nucleotide sequence encoding the Hpa1 protein, the sequencing of which allows for eff icient differentiation of X. oryzae species. The analytical specif icity of the system was tested using the DNAs of 53 closely related and accompanying microorganisms and comprised 100 % with no false-positive or false-negative results registered. The system's analytical sensitivity was not less than 25 copies per PCR reaction. Its eff icacy has been conf irmed using f ive different qPCR detection systems from different manufacturers, so it can be recommended for diagnostic and screening studies. Бактерии рода Xanthomonas Dowson, 1939 поражают около 400 видов растений, в том числе важные сельскохозяйственные культуры. Бактериальная полосатость риса – одно из самых разрушительных заболеваний, вызвано бактериями вида Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang et al., 1957) Swings et al., 1990. Сильное сходство симптомов поражения с другим карантинным близкородственным патовариантом – Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ishiyama, 1922) Swings et al., 1990, а также возможность совместного заражения делают визуальную идентификацию невозможной. Карантинный статус и высокая вредоносность патогена требуют высокоэффективного, быстрого и точного метода его диагностики. Целью исследования были разработка и апробация наборов реагентов для выявления бактерии Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, вызывающей бактериальную полосатость листьев риса, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР- РВ), а также ПЦР с последующим секвенированием ампликонов. В работе изучены образцы ДНК X. o. pv. oryzae и X. o. pv. oryzicola, полученные из коллекции CIRM-CFBR (Франция). Для проверки аналитической чувствитель- ности была создана конструкция на основе вектора pAL2-T с целевой вставкой 290 п. н. Были подобраны и апробированы праймеры и зонд для специфической амплификации фрагмента гена hpa1 методом ПЦР-РВ, позволяющие обнаруживать ДНК X. o. pv. oryzicola. Показана способность с помощью разработанных прай- меров обнаруживать все штаммы X. o. pv. oryzicola, последовательности которых находились в базе данных GenBank NCBI на 11.11.2021. Аналитическая специфичность набора реагентов протестирована на выборке из ДНК, выделенных из 53 близкородственных и сопутствующих организмов, и составила на исследованной выборке 100 %. Ложноположительных и ложноотрицательных результатов не обнаружено. Проверка анали- тической чувствительности показала, что стабильный специфичный сигнал ПЦР-РВ наблюдался при разведе- нии контрольной плазмиды до 25 копий на реакцию. Работоспособность полученного набора реагентов была подтверждена тестированием на пяти приборах для ПЦР-РВ разных производителей, что дает возможность рекомендовать его для проведения диагностических и скрининговых исследований. Праймеры для секвени- рования seqX.o.all были подобраны на последовательность кластера генов hrp, а именно на нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Hpa1. Секвенирование выбранного участка позволяет эффективно дифференцировать бактерии вида X. oryzae.