Abstract
Spanish Much diseased human myocardial tissue is fibrotic and stiff, which increases the work that the ventricular myocytes must perform to maintain cardiac output. The hypothesis tested is that the increased load due to greater stiffness of the substrata drives sarcomere assembly of cells, thus strengthening them. Neonatal rat ventricular myocytes (NRVM) were cultured on polyacrylamide or polydimethylsiloxane substrates with stiffness of 10 kPa, 100 kPa, or 400 kPa, or glass with stiffness of 61.9 GPa. Cell size increased with stiffness. Two signaling pathways were explored, phosphorylation of focal adhesion kinase (p-FAK) and lipids by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Subcellular distributions of both were determined in the sarcomeric fraction by antibody localization, and total amounts were measured by Western or dot blotting, respectively. More p-FAK and PIP2 distributed to the sarcomeres of NRVM grown on stiffer substrates. Actin assembly involves the actin capping protein Z (CapZ). Both actin and CapZ dynamic exchange were significantly increased on stiffer substrates when assessed by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of green fluorescent protein tags. Blunting of actin FRAP by FAK inhibition implicates linkage from mechano-signalling pathways to cell growth. Thus, increased stiffness of cardiac disease can be modeled with polymeric materials to understand how the microenvironment regulates cardiac hypertrophy. Une bonne partie du tissu myocardique pathologique chez l’homme est fibrotique et rigide, ce qui augmente le travail imposé aux myocytes ventriculaires pour maintenir le débit cardiaque. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle l’augmentation de la charge provoquée par l’augmentation de la rigidité des substrats commande l’assemblage des cellules en sarcomères, ce qui les fortifie. Nous avons mis des myocytes ventriculaires de rats nouveau-nés (MVRN) en culture sur un substrat de polyacrylamide ou de polydiméthylsiloxane avec des rigidités de 10 kPa, de 100 kPa ou de 400 kPa, ou sur du verre dont la rigidité était de 61,9 GPa. La taille des cellules augmentait en fonction de la rigidité. Nous avons étudié 2 voies de signalisation : celle de la phosphorylation de la p-FAK (<< focal adhesion kinase >>) et celle des lipides par le PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate). Nous avons établi la répartition subcellulaire de chacune d’elles dans la fraction sarcomérique a` l’aide de la technique de localisation d’anticorps et nous avons mesuré leur quantité totale a` l’aide des techniques de buvardage de western et << en point >> (<< dot blot >>), respectivement. Plus de p-FAK et de PIP2 étaient répartis dans les sarcomères de MVRN sur des substrats plus rigides. L’assemblage de l’actine met en jeu la protéine de coiffage de l’actine CapZ (pour << actin capping protein Z >>). L’évaluation de la récupération de la fluorescence après photoblanchiment (FRAP pour << fluorescence recovery after photobleaching >>) de marqueurs protéiques verts fluorescents nous a permis d’observer que les échanges dynamiques de l’actine comme de la CapZ augmentaient de façon marquée sur des substrats plus rigides. L’atténuation de la FRAP de l’actine par l’inhibition de la FAK trace un lien entre les voies de signalisation mécaniques et la croissance des cellules. Par conséquent, l’augmentation de la rigidité observée en cas de maladie cardiaque peut être modélisée a` l’aide de matériaux polymères en vue de comprendre comment le microenvironnement assure la régulation de l’hypertrophie cardiaque. [Traduit par la Rédaction]