Abstract
Abstract in English, Russian One of the most productive strategies for finding the functions of proteins is to study the consequences of loss of protein function. For this purpose, cells or organisms with a knockout of the gene encoding the protein of interest are obtained. However, many proteins perform important functions and cells or organisms could suddenly lose fitness when the function of a protein is lost. For such proteins, the most productive strategy is to use inducible protein degradation systems. A system of auxin-dependent protein degradation is often implemented. To use this system, it is sufficient to introduce a transgene encoding a plant-derived auxin-dependent ubiquitin ligase into mammalian cells and insert a sequence encoding a degron domain into the gene of interest. A crucial aspect of development of cell lines engineered for inducible protein depletion is the selection of cell clones with efficient auxin-dependent degradation of the protein of interest. To select clones induced by depletion of the architectural chromatin proteins RAD21 (a component of the cohesin complex) and SMC2 (a component of the condensin complex), we propose to use the morphology of metaphase chromosomes as a convenient functional test. In this work, we obtained a series of clones of human HAP1 cells carrying the necessary genetic constructs for inducible depletion of RAD21 and SMC2. The degradation efficiency of the protein of interest was assessed by flow cytometry, Western blotting and metaphase chromosome morphology test. Based on our tests, we showed that the clones we established with the SMC2 degron effectively and completely lose protein function when induced by auxin. However, none of the HAP1 clones we created with the RAD21 degron showed complete loss of RAD21 function upon induction of degradation by auxin. In addition, some clones showed evidence of loss of RAD21 function even in the absence of induction. The chromosome morphology test turned out to be a convenient and informative method for clone selection. The results of this test are in good agreement with flow cytometry analysis and Western blotting data. Одна из самых продуктивных стратегий поиска функций различных белков – исследование последствий потери функции белка. Часто для этого получают клетки или организмы с нокаутом гена, кодирующего белок интереса. Однако многие белки выполняют настолько важные функции, что клетка или организм резко теряют жизнеспособность при потере функции такого белка. Для этих белков наиболее продуктивной стратегией является применение систем индуцируемой деградации белка. Часто используют систему ауксин - зависимой деградации белков. Для применения этой системы достаточно ввести в клетки млекопитающих трансген, кодирующий растительную ауксин-зависимую убиквитин лигазу, и включить в ген интереса последовательность, кодирующую дегроновый домен. Важный этап создания клеток, способных к индуцируемой деплеции белка, – отбор клеточных клонов с эффективной ауксин-зависимой деградацией белка интереса. Для отбора клонов с индуцируемой деплецией архитектурных белков хроматина RAD21 (компонент когезинового комплекса) и SMC2 (компонент конденсинового комплекса) мы предлагаем использовать морфологию метафазных хромосом как удобный функциональный тест. В данной работе мы получили серию клонов клеток человека HAP1, несущих необходимые генетические конструкции для индуцируемой деплеции RAD21 и SMC2. Эффективность деградации белка интереса была оценена с помощью проточной цитофлуориметрии, Вестерн-блоттинга и теста на морфологию метафазных хромосом. На основе проведенных тестов мы продемонстрировали, что созданные нами клоны с дегроном SMC2 эффективно и полно теряют функцию белка при индукции ауксином. При этом ни один из созданных нами клонов HAP1 с дегроном RAD21 не показал полной потери функции RAD21 при индукции деградации ауксином. Кроме того, некоторые клоны имели признаки потери функции RAD21 даже в отсутствие индукции. Использованный нами тест на морфологию хромосом оказался удобным и информативным для отбора клонов. Результаты этого теста хорошо согласуются с данными проточной цитофлуориметрии анализа и Вестерн-блоттинга.