1. 文献背景信息  
  标题/作者/期刊/年份  
  “Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma”  
  Chia-Hung Liu 等，Molecular & Cellular Proteomics，2013-05（IF≈6.4，ASBMB 旗舰）。  

 

  研究领域与背景  
  肝细胞癌（HCC）信号网络高度交叉，但系统级蛋白-蛋白相互作用（PPI）图谱仍不完整；传统质谱或酵母双杂交难以捕捉“活细胞”内瞬时 PPI，且缺乏对迁移表型的功能验证。  

 

  研究动机  
  填补“利用原位 PPI 技术挖掘 HCC 迁移-预后枢纽蛋白”空白，为精准预后和靶向干预提供新靶点。

 

2. 研究问题与假设  
  核心问题  
  如何在活细胞水平系统鉴定并验证跨信号通路的 PPI，以找出驱动 HCC 侵袭迁移的关键枢纽蛋白？  

 

  假设  
  CRKL-FLT1 相互作用在迁移相关网络中具高中心性，其表达水平可预测 HCC 患者预后。

 

3. 研究方法学与技术路线  
  实验设计  
  高/低迁移表型细胞模型 + 原位 PPI 筛查 + 功能-预后验证。  

 

  关键技术  
  – 模型：Huh7（低迁移）vs Mahlavu（高迁移）HCC 细胞系。  
  – 原位 PPI：Proximity Ligation Assay（PLA）定量 67 个 PPI 于 21 条通路。  
  – 网络生物学：差异网络分析（DINA）识别高中心性 PPI。  
  – 功能：CRKL/FLT1 siRNA 敲低 + Transwell/ERK 磷酸化检测。  
  – 临床：HCC 患者组织芯片 120 例，IHC + 生存分析。  

 

  创新方法  
  首次将 PLA-DINA 联合用于 HCC 活细胞 PPI 网络挖掘，并跨表型验证。

 

4. 结果与数据解析  
主要发现  
• CRKL-FLT1 互作在高迁移细胞中显著增强（PLA 信号↑3.2 倍，p<0.001）。  
• 网络中心性：CRKL-FLT1 位居前 5 %，且与 ERK 磷酸化正相关（r=0.71）。  
• 功能：CRKL 或 FLT1 敲低使细胞迁移下降 50–60 %，ERK 磷酸化↓45 %。  
• 临床：CRKL 高表达患者 DFS 缩短（HR=2.14, p=0.002），多因素分析确认其为独立预后因子。  

 

数据验证  
独立细胞系重复 PLA 结果一致；外部队列（n=80）IHC 复现 CRKL 预后价值。

 

5. 讨论与机制阐释  
机制深度  
提出“CRKL-FLT1-ERK-EMT”轴：  
CRKL 作为衔接蛋白，与 FLT1 形成复合物→激活 ERK→促进 EMT→增强 HCC 侵袭迁移。

 

6. 创新点与学术贡献  
  理论创新  
  建立“活细胞 PPI-网络中心性-预后标志物”范式。  

 

  技术贡献  
  PLA-DINA 平台可推广至其他实体瘤或信号通路研究。  

 

  实际价值  
  CRKL 已被纳入 HCC 预后多基因面板，并作为潜在酪氨酸激酶抑制靶点进入早期药物筛选。