XPR1调控胎肝巨噬细胞的发育、特性和核仁细胞清除

1. 领域背景与文献

文献英文标题：XPR1 regulates fetal liver macrophage development, identity, and pyrenocyte clearance；

发表期刊：未明确；影响因子：未公开；研究领域：发育免疫学，组织驻留巨噬细胞发育调控，红细胞生成生物学。

无机磷酸盐是胚胎生长发育和代谢必需的小分子物质，其稳态失衡会导致骨矿化异常或组织异位钙化。领域共识：磷酸盐稳态由高度保守的转运分子精准调控，溶质载体家族SLC20、SLC34是主要的磷酸盐输入蛋白，异嗜性和多嗜性逆转录病毒受体1（XPR1）是目前已知多细胞生物中唯一的磷酸盐输出蛋白。既往研究证实，XPR1缺失会导致小鼠生长缺陷和胚胎或新生鼠致死，人类XPR1功能缺失突变会导致原发性家族性脑钙化，一种以基底神经节血管钙化为特征的神经退行性疾病。此前在斑马鱼模型中的研究发现，XPR1对小胶质细胞和朗格汉斯细胞的发育分化是必需的，但该功能是否在哺乳动物中保守，以及XPR1是否对其他巨噬细胞亚群的发育存在调控作用，此前完全未知。

组织驻留巨噬细胞是维持器官稳态的核心免疫细胞，其中红系岛巨噬细胞是支持红细胞生成的关键巨噬细胞亚群，定位于胎肝、骨髓等造血器官，除提供发育信号外，核心功能是吞噬并清除成熟红细胞排出的细胞核（即焦核），红系岛巨噬细胞功能发育异常会导致红细胞生成障碍，引发贫血甚至胚胎致死。现有研究已经明确了部分调控枯否细胞（肝脏驻留巨噬细胞，与胎肝红系岛巨噬细胞存在高度转录重叠）发育的关键分子，如转录因子Id3、肝X受体α等，但代谢相关分子尤其是磷酸盐转运蛋白在红系岛巨噬细胞发育中的作用尚未被报道，领域仍存在研究空白。本研究针对这一空白，明确XPR1在哺乳动物红系岛巨噬细胞发育和功能中的作用，为理解红细胞生成的调控机制提供新的理论基础。

2. 文献综述解析

作者从两个维度对现有研究进行梳理，第一个维度是磷酸盐转运蛋白XPR1的研究进展，现有研究已经明确了XPR1作为唯一多细胞生物磷酸盐输出蛋白的核心功能，解析了其在人类神经退行性疾病和小鼠胚胎发育中的作用，证实XPR1是维持磷酸盐稳态必需的分子，现有研究的局限性在于大多聚焦于XPR1在中枢神经系统钙化和全身磷酸盐稳态中的作用，对其在免疫细胞发育中的功能研究非常有限，仅在斑马鱼中发现其对部分巨噬细胞亚群发育的作用，缺乏哺乳动物中的研究验证。第二个维度是组织驻留巨噬细胞发育调控研究，现有研究已经明确了组织驻留巨噬细胞的胚胎起源，证实不同组织巨噬细胞的发育依赖组织微环境特异性的信号和转录程序，也明确了红系岛巨噬细胞在支持红细胞生成中的核心功能，现有研究的局限性在于对代谢分子尤其是磷酸盐转运相关分子在红系岛巨噬细胞发育中的作用完全不明确，缺乏针对性的功能研究。

基于现有研究的不足，本研究的创新价值十分明确，首次在哺乳动物小鼠模型中证实XPR1是红系岛巨噬细胞发育和功能维持的非冗余关键调控因子，打破了既往仅将XPR1视为磷酸盐转运蛋白和神经疾病相关分子的认知，揭示了XPR1在巨噬细胞发育和红细胞生成中的新功能，填补了代谢调控红系岛巨噬细胞发育领域的研究空白，为后续研究红细胞生成相关疾病提供了新的候选靶点。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的目标是明确XPR1在小鼠组织驻留巨噬细胞发育中的作用，核心科学问题是XPR1是否以及如何特异性调控红系岛巨噬细胞的发育和焦核清除功能，整体技术路线为：全基因敲除筛选XPR1影响的巨噬细胞亚群→条件性敲除明确XPR1作用的细胞特异性→多组学分析解析XPR1对巨噬细胞发育转录程序的调控→功能实验验证XPR1缺失对焦核清除功能的影响→成年动物模型验证XPR1对红系相关巨噬细胞的稳态维持作用，形成了从表型发现到机制解析再到功能验证的完整研究闭环。

3.1 全基因敲除模型筛选XPR1调控的巨噬细胞亚群

实验目的：明确XPR1缺失对小鼠胚胎不同器官组织驻留巨噬细胞发育的影响，确认XPR1是否特异性调控特定巨噬细胞亚群。
方法细节：使用Xpr1LacZ/+杂合小鼠交配获得不同基因型胚胎，在胚胎发育不同时间点分离脑、皮肤、心脏、肺、肾脏、胎肝等器官，制备单细胞悬液后进行流式细胞术染色，分析不同巨噬细胞亚群的频率和单位组织重量的绝对细胞数量。
结果解读：流式细胞术统计结果显示，与野生型对照相比，Xpr1LacZ/LacZ全基因敲除胚胎脑内小胶质细胞、边缘相关巨噬细胞，皮肤朗格汉斯细胞前体，以及心脏、肺、肾脏的巨噬细胞频率和数量均无显著差异（n=5-16，P>0.05）；而胎肝中F4/80高表达CD11b低表达的胎肝巨噬细胞频率和绝对数量均显著降低（n=5-16，P<0.0001），同时胎肝内Ly6C高表达单核细胞的频率和数量显著升高（n=5-16，P<0.01），证实XPR1特异性调控胎肝巨噬细胞的发育。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用流式细胞仪、胶原酶、荧光标记抗体等试剂/仪器。

3.2 造血细胞特异性条件敲除验证细胞内在作用

实验目的：明确XPR1是否通过细胞内在作用调控造血细胞向胎肝巨噬细胞分化。
方法细节：使用Vav1iCre小鼠在胚胎发育E8.5开始特异性敲除造血细胞中的Xpr1，获得Vav1iCreXpr1fl/fl敲除胚胎和Xpr1fl/fl对照胚胎，E16.5分离胎肝细胞进行流式细胞术高维聚类分析，结合免疫荧光染色观察巨噬细胞的组织分布，同时分选单核细胞和内皮细胞进行定量反转录聚合酶链反应验证敲除效率。
结果解读：定量反转录聚合酶链反应结果显示，分选的Ly6C高表达单核细胞中Xpr1信使RNA几乎完全缺失（n=3，P<0.001）；流式细胞术分析发现Vav1iCreXpr1fl/fl胚胎胎肝中经典胎肝巨噬细胞几乎完全缺失（n=4-8，P<0.01），Ly6C高表达单核细胞频率显著升高（n=4-8，P<0.01）；高维流式聚类发现XPR1缺失后胎肝出现两个不存在于对照胚胎的单核/巨噬细胞样群体，这些细胞不表达经典胎肝巨噬细胞标记Tim4；免疫荧光染色也证实Vav1iCreXpr1fl/fl胎肝几乎不存在F4/80和IBA1阳性的经典巨噬细胞网络，同时CD64阳性细胞中脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色信号显著升高，说明XPR1缺失后单核/巨噬细胞凋亡增加（n=4，P<0.01），证实XPR1是造血细胞内在的胎肝巨噬细胞发育调控因子。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用CRISPR基因编辑技术构建基因修饰小鼠、荧光定量PCR试剂、激光共聚焦显微镜等。

3.3 单细胞转录组测序解析发育程序调控

实验目的：明确XPR1缺失如何影响胎肝巨噬细胞的转录发育程序。
方法细节：分选E15.5Xpr1fl/fl对照和Vav1iCreXpr1fl/fl敲除胎肝的CD45阳性Lin阴性细胞，进行单细胞RNA测序，对细胞进行聚类和注释，分析不同细胞群的基因表达特征，同时进行RNA轨迹分析推断细胞发育方向，另外开展体外巨噬细胞分化实验验证发育缺陷。
结果解读：单细胞RNA测序共获得16个细胞聚类，对照样本中存在明确的成熟巨噬细胞聚类，而Vav1iCreXpr1fl/fl样本中巨噬细胞聚类几乎完全缺失，取而代之的是富集干扰素调控基因的单核细胞聚类；只有对照中的真正确认胎肝巨噬细胞高表达枯否细胞核心基因特征如Timd4、Clec4f等，而XPR1缺失产生的单核样细胞仅高表达单核细胞特征基因，虽然部分单核细胞表达部分肝巨噬细胞转录因子，但是无法激活完整的肝巨噬细胞转录程序；RNA轨迹分析显示XPR1缺失后细胞发育轨迹朝向干扰素特征的单核细胞而非成熟巨噬细胞；体外巨噬细胞分化实验也显示XPR1缺失胎肝细胞生成巨噬细胞的效率显著降低（n=4-7，P<0.01），证实XPR1缺失导致胎肝巨噬细胞发育程序受阻。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用10×Genomics单细胞建库测序平台、生物信息学分析软件。

3.4 功能实验验证焦核清除功能缺陷

实验目的：明确胎肝巨噬细胞XPR1缺失对红细胞成熟和焦核清除功能的影响。
方法细节：制备E15.5Vav1iCreXpr1fl/fl和对照胚胎外周血涂片，染色后统计有核红细胞比例，使用血液分析仪检测血常规参数，同时对胎肝组织进行免疫组织化学染色，统计CD64阳性细胞中含有的焦核数量，结合单细胞转录组数据分析焦核降解相关基因的表达水平。
结果解读：外周血涂片结果显示，Vav1iCreXpr1fl/fl和对照胚胎之间有核红细胞比例无显著差异（n=7-8，P>0.05），血常规参数包括红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞比容等也均无显著差异（n=8-11，P>0.05），说明红细胞脱核过程不受XPR1缺失影响；而免疫组织化学染色显示Vav1iCreXpr1fl/fl胎肝中含焦核的CD64阳性细胞数量显著高于对照（n=5，P<0.0001）；单细胞转录组数据显示XPR1缺失的干扰素激活单核/巨噬细胞中，焦核降解关键基因Dnase2a以及组织蛋白酶基因Ctsd、Ctsl、Ctsb的表达水平显著低于对照胎肝巨噬细胞，证实XPR1缺失不影响红细胞脱核，但会导致焦核清除功能缺陷。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用全自动血液分析仪、组织病理染色试剂。

3.5 分化后条件敲除验证功能维持作用

实验目的：排除发育阶段缺失的间接影响，明确XPR1在分化后胎肝巨噬细胞功能维持中的作用。
方法细节：使用Mrc1Cre在分化的CD206阳性巨噬细胞中条件性敲除Xpr1，获得Mrc1CreXpr1fl/fl敲除和对照胚胎，流式细胞术检测巨噬细胞频率，定量反转录聚合酶链反应验证敲除效率，免疫组织化学染色统计焦核数量，分选巨噬细胞进行批量RNA测序分析转录组变化，最后在成年小鼠中分析XPR1缺失对不同组织红系相关巨噬细胞的影响。
结果解读：流式细胞术结果显示Mrc1CreXpr1fl/fl胚胎胎肝巨噬细胞频率无显著变化（n=11，P>0.05），但定量反转录聚合酶链反应证实Xpr1表达显著降低（n=3-11，P<0.05）；免疫组织化学染色显示焦核包含细胞数量显著增加（n=5-7，P<0.01），Dnase2a表达显著降低（n=4，P<0.01）；批量RNA测序显示XPR1缺失巨噬细胞和对照巨噬细胞转录组存在显著分离，XPR1缺失后枯否/胎肝巨噬细胞特征基因显著下调，干扰素刺激基因显著上调，红系岛巨噬细胞特征基因大部分丢失；成年Mrc1CreXpr1fl/fl小鼠肝脏枯否细胞、脾脏红髓巨噬细胞、骨髓CD163阳性Tim4阳性红系岛巨噬细胞数量均显著降低，其中骨髓CD163阳性Tim4阳性巨噬细胞几乎完全缺失（n=4-6，P<0.0001），证实XPR1对分化后红系岛巨噬细胞的身份维持和功能也是必需的。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用转录组测序建库试剂、流式细胞仪。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究未筛选用于疾病诊断或预后的新型生物标志物，明确了XPR1是红系岛巨噬细胞（包括胎肝巨噬细胞、脾脏红髓巨噬细胞、骨髓红系岛巨噬细胞）发育和功能维持的特异性调控分子，其研究逻辑为：通过全基因敲除筛选发现XPR1特异性影响胎肝巨噬细胞发育，通过造血细胞特异性条件敲除明确其细胞内在作用，通过单细胞转录组测序解析其对发育程序的调控，通过功能实验验证其对焦核清除功能的影响，最后在成年小鼠多个红系相关巨噬细胞亚群中验证了该作用，逻辑链条完整。

研究过程中，XPR1作为候选调控分子，其表达来源于小鼠胚胎胎肝造血细胞，研究通过基因敲除结合流式细胞术、免疫荧光染色、多组学测序验证其功能，在Vav1iCre造血细胞敲除模型中，胎肝巨噬细胞数量降低超过90%（n=4-8，P<0.01）；在Mrc1Cre分化后敲除模型中，成年肝脏枯否细胞数量降低约50%（n=7-8，P<0.01），脾脏红髓巨噬细胞数量降低超过60%（n=3-5，P<0.001），骨髓CD163+Tim4+红系岛巨噬细胞几乎完全缺失（n=4-6，P<0.0001）；焦核清除实验中，Mrc1CreXpr1fl/fl胎肝中含焦核的CD64阳性细胞数量是对照的2.3倍（n=5-7，P<0.01）。

本研究的核心成果为：首次在哺乳动物小鼠中证实XPR1是红系岛巨噬细胞发育、身份确立和功能维持的非冗余关键调控因子，明确XPR1缺失不影响红细胞脱核过程，但会通过下调焦核降解关键基因Dnase2a和组织蛋白酶的表达导致焦核清除缺陷，进而诱导干扰素激活的炎症型单核巨噬细胞产生；同时证实XPR1对成年小鼠红系相关巨噬细胞的稳态维持必不可少，该结论在多个独立的基因修饰小鼠模型中得到验证，所有核心结论的统计学显著性均达到P<0.01及以上。本研究填补了代谢分子调控组织驻留红系岛巨噬细胞发育领域的研究空白，为后续研究红细胞生成相关疾病（如遗传性贫血、红细胞生成障碍）的发病机制提供了新的候选靶点。