通过嵌合纳米抗体-脂质共组装制备肿瘤mRNA-脂质纳米颗粒

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Tumor mRNA-lipid nanoparticles via chimeric nanobody-lipid co-assembly；

发表期刊：文献未明确提供；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤免疫治疗，信使核糖核酸疫苗递送。

领域共识：信使核糖核酸（mRNA）疫苗在新冠疫情期间发展为突破性技术，该技术通过递送编码特定抗原的合成信使核糖核酸进入细胞，诱导机体产生免疫应答，其开发迅速、疗效高、适应性强的特点推动了其在肿瘤治疗领域的研究拓展。当前基于信使核糖核酸的肿瘤疫苗核心方向是刺激机体对肿瘤相关抗原的免疫识别，但疗效始终受限于肿瘤抗原免疫原性弱、肿瘤进化带来的免疫逃逸，过去四十年肿瘤抗原靶向疫苗的不佳结果也充分印证了这一挑战。

随后发展出的替代策略是通过外源递送让肿瘤细胞表达特定新抗原，从而诱导特异性免疫杀伤，该策略已经通过质粒DNA、病毒、微生物等递送方式进行了探索，但递送方法存在实际应用障碍，瘤内注射无法适用于所有类型肿瘤，肌肉注射无法实现肿瘤细胞的靶向新抗原表达。为解决这些局限，已有研究通过在脂质纳米粒（LNP）中引入靶向基团，开发了可静脉给药的肿瘤靶向信使核糖核酸疫苗。肿瘤靶向信使核糖核酸-脂质纳米粒可以特异性诱导肿瘤细胞表达选定的新抗原，促进抗肿瘤免疫应答，同时降低对正常组织的损伤，但目前靶向配体接枝脂质纳米粒的生产效率仍然较低。传统方法需要将靶向配体化学偶联到脂质纳米粒表面，整个过程涉及化学基团活化、配体固定、未反应基团封盖多步操作，多步工艺会破坏配体稳定性，导致包载内容物泄露，还会造成产物损失，此外，使用聚乙二醇增强脂质纳米粒稳定性可能引发免疫原性，重复暴露于聚乙二醇会诱导抗聚乙二醇抗体生成，导致脂质纳米粒被快速清除，还会引发超敏反应。

现有研究尚未解决制备工艺低效、聚乙二醇免疫原性、靶向递送效率不足的问题，缺乏简便、高效的无聚乙二醇肿瘤靶向信使核糖核酸递送平台，因此本研究开发通过棕榈酰化纳米抗体、脂质、编码刺突蛋白的信使核糖核酸自组装制备无聚乙二醇的人表皮生长因子受体2靶向信使核糖核酸-脂质纳米粒，利用人群中已经存在的抗刺突蛋白预存免疫杀伤肿瘤细胞，为肿瘤免疫治疗提供全新的技术平台。

2. 文献综述解析

作者将现有相关研究按照技术路线和功能特点分为四类，分别为配体偶联聚乙二醇化脂质纳米粒肿瘤信使核糖核酸疫苗、聚乙二醇替代物修饰脂质纳米粒、无聚合物蛋白冠脂质纳米粒、传统靶向脂质纳米粒制备工艺，对各类研究的优势和局限性进行了梳理。配体偶联聚乙二醇化脂质纳米粒已经展现出一定的免疫治疗潜力，但这类体系普遍依赖聚乙二醇作为稳定剂，存在抗聚乙二醇免疫反应的潜在风险，部分双靶向配体修饰体系采用非共价结合方式，存在配体从脂质纳米粒表面脱落的风险，多数研究仅验证了递送效率，未评估体内治疗效果，甚至部分研究未涉及信使核糖核酸递送，也没有验证肿瘤治疗结局。针对聚乙二醇的免疫原性问题，已有研究开发了聚羧基甜菜碱脂质、高密度刷状聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯脂质等聚乙二醇替代物，这些替代物可以降低免疫原性，减少抗聚乙二醇抗体的影响，但都没有引入主动靶向功能，也未验证治疗效果。无聚合物策略通过在脂质纳米粒表面形成蛋白冠实现完全无聚乙二醇化，载脂蛋白E、载脂蛋白A1等修饰的脂质纳米粒已经被证明可以有效递送核酸，但这类体系主要靶向肝脏组织，无法实现肝外肿瘤的靶向。传统制备肿瘤靶向脂质纳米粒的工艺，包括点击化学法，都需要多步的表面活化、偶联、纯化操作，即使每个步骤仅损失10%，总产率也通常不超过65%，整个制备过程至少需要12小时，而且最终能成功偶联到脂质纳米粒表面的靶向配体比例很低。

通过对现有研究的梳理，本研究的创新价值主要体现在三个方面，第一，用棕榈酰化纳米抗体直接插入脂质膜替代传统聚乙二醇依赖的配体偶联策略，不需要多步化学修饰即可实现脂质纳米粒表面的高密度配体展示，解决了传统工艺产率低、配体偶联效率低的问题；第二，通过调控辅助脂质组成，促进形成非层状脂质纳米粒结构，更有利于信使核糖核酸的内体逃逸和胞质递送，提升递送效率；第三，本平台利用人群中已经存在的针对非肿瘤抗原如刺突蛋白的预存免疫，增强对肿瘤细胞的免疫识别和清除，是概念上完全不同的肿瘤免疫治疗新策略。此外，本研究的制备工艺简便，仅需一步自组装，配体密度可调控，兼容微流控生产，易于规模化，并且完成了体外细胞实验和体内动物实验的疗效验证，弥补了现有研究多数仅验证递送效率不验证治疗效果的不足。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标是开发一步自组装的无聚乙二醇肿瘤靶向信使核糖核酸-脂质纳米粒递送平台，利用预存免疫实现有效的肿瘤免疫治疗，核心科学问题是解决传统肿瘤靶向脂质纳米粒制备工艺低效、聚乙二醇免疫原性、信使核糖核酸递送效率低的问题，技术路线为：工程化改造人源化棕榈酰化抗人表皮生长因子受体2纳米抗体→制备不同组成的纳米抗体修饰脂质纳米粒并完成理化性质表征→优化脂质组成和纳米抗体用量，验证体外靶向特异性和信使核糖核酸递送效率→体外验证刺突蛋白激活的T细胞免疫杀伤效果→体内荷瘤模型验证肿瘤靶向富集和抗肿瘤疗效，形成了从工艺开发到功能验证的完整研究闭环。

3.1 棕榈酰化抗人表皮生长因子受体2纳米抗体的人源化改造与表征

实验目的：对原有抗人表皮生长因子受体2纳米抗体进行人源化改造，获得可插入脂质纳米粒膜的棕榈酰化纳米抗体，降低免疫原性并保留结合亲和力。方法细节：对课题组前期获得的抗人表皮生长因子受体2纳米抗体进行人源化改造，构建从N端到C端依次为人源化纳米抗体、柔性（G4S）4连接肽、棕榈酰尾巴的工程化棕榈酰化纳米抗体，通过HEK293T细胞转染质粒表达目的蛋白，采用镍亲和层析纯化、超滤浓缩获得终产物，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻高效液相色谱、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱验证蛋白纯度和分子量，利用生物膜层干涉技术检测棕榈酰化纳米抗体与人表皮生长因子受体2的结合动力学。结果解读：人源化改造后，体外干扰素-γ、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α释放量降低约15到50倍（n=12，P<0.05），免疫原性显著降低；棕榈酰化纳米抗体的产量比含α螺旋单跨膜肽的嵌合纳米抗体提高250倍以上，从40毫升培养上清中可获得约11.7毫克纯度96%的棕榈酰化纳米抗体，同等体积上清仅能获得约44.8微克纯度95%的嵌合纳米抗体（文献未明确提供该数据的统计学显著性）；棕榈酰化纳米抗体的解离常数为1.19纳摩尔，与未改造纳米抗体的0.53纳摩尔接近，证明约7纳米的中性连接肽和约2.4纳米的棕榈酰尾巴不会影响纳米抗体的结合亲和力。实验所用关键产品：文献未提及具体品牌的核心实验产品，领域常规使用分子克隆、蛋白表达纯化与亲和力检测类试剂/仪器。

3.2 棕榈酰化纳米抗体修饰脂质纳米粒的制备与体外理化性质表征

实验目的：验证棕榈酰化纳米抗体整合入脂质纳米粒膜的能力，优化纳米抗体用量和脂质组成，获得性质稳定、递送效率高的靶向脂质纳米粒。方法细节：将可电离脂质SM102、胆固醇、二油酰磷脂乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱按不同摩尔比混合制备乙醇相，与含有新冠刺突蛋白信使核糖核酸和棕榈酰化纳米抗体的醋酸钠缓冲液水相经微流控混合，经过透析、超滤除去未包载物质后获得脂质纳米粒，采用荧光显微镜观察棕榈酰化纳米抗体的整合情况，通过紫外可见光谱、荧光共振能量转移检测棕榈酰化纳米抗体的整合效率与分布，Micro-BCA法检测棕榈酰化纳米抗体的锚定效率，RiboGreen法检测信使核糖核酸包封率，采用Laurdan实验、差示扫描量热法、圆二色谱检测脂质纳米粒的热稳定性，通过冷冻透射电镜、小角X射线散射表征脂质纳米粒的微观结构，检测不同配方的粒径、多分散性指数、Zeta电位、酸解离常数，进一步验证不同配方的信使核糖核酸细胞递送效率。结果解读：棕榈酰化纳米抗体可通过棕榈酰尾巴自发整合入脂质纳米粒膜，无棕榈酰尾巴的纳米抗体无法与脂质膜结合；棕榈酰化纳米抗体在脂质纳米粒膜均匀分布，当棕榈酰化纳米抗体与脂质纳米粒的输入比例从200:1提升到4000:1时，每个脂质纳米粒实际整合的纳米抗体数量从194提升到2526，锚定效率从97.1%下降到63.2%，每个直径约70纳米的脂质纳米粒可整合超过200个棕榈酰化纳米抗体，远高于现有研究报道的每个聚乙二醇化脂质纳米粒仅偶联2-7个抗体的水平；含6%-35%二硬脂酰磷脂酰胆碱的脂质纳米粒在45摄氏度仍保持稳定，输入2000摩尔比棕榈酰化纳米抗体时，每个脂质纳米粒可整合约1500个纳米抗体，足够形成蛋白冠防止脂质纳米粒聚集，该条件下信使核糖核酸包封率达到91%-96%，与聚乙二醇化脂质纳米粒相当，提高二油酰磷脂乙醇胺比例可显著增强细胞对信使核糖核酸的递送效率（n=5，P<0.001）。

冷冻透射电镜和小角X射线散射结果显示，当二硬脂酰磷脂酰胆碱与二油酰磷脂乙醇胺比例为6:29时，可形成由无序六方相、少量层状相、反胶束相混合组成的非层状结构，不含二油酰磷脂乙醇胺会形成刚性多层层状结构，不含二硬脂酰磷脂酰胆碱会导致脂质纳米粒聚集或融合成片状结构；非层状结构比层状结构更易破坏膜结构，促进信使核糖核酸的胞质递送，细胞内运输实验显示，脂质体转染试剂组的信使核糖核酸仅部分从溶酶体逃逸到胞质，聚乙二醇化脂质纳米粒组细胞内化水平有限，而棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒组可观察到大量信使核糖核酸存在于内体区室之外，证明有效的内体逃逸和胞质递送，部分支持了非层状结构促进信使核糖核酸胞质递送的观点。稳定性实验显示，棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒在4摄氏度储存30天，粒径、信使核糖核酸含量、表面电荷均无显著变化，30小时内信使核糖核酸漏出率极低，因此该优化配方（棕榈酰化纳米抗体2000输入比例）被用于后续实验。

实验所用关键产品：赛默飞世尔的Lipofectamine 3000、Quant-iT™ RiboGreen检测试剂盒，西格玛的Triton X-100、6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸，其余未明确具体品牌，领域常规使用纳米粒制备与理化表征类试剂/仪器。

3.3 体外靶向特异性与免疫杀伤验证

实验目的：验证棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒的人表皮生长因子受体2靶向特异性，以及刺突蛋白激活的CD3+T细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤效果。方法细节：分别在人表皮生长因子受体2过表达SK-BR-3细胞和人表皮生长因子受体2阴性MDA-MB-231细胞中，通过流式细胞术、酶联免疫吸附实验检测不同脂质纳米粒的细胞内化效率和刺突蛋白表达量；随后制备刺突蛋白负载树突状细胞，激活CD3+T细胞，将激活后的T细胞分别与刺突蛋白过表达HEK293T细胞、棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒处理的SK-BR-3细胞、棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒处理的MDA-MB-231细胞共培养，通过流式细胞术和实时细胞分析检测杀伤效率，检测上清中干扰素-γ水平。结果解读：转染SK-BR-3细胞后，棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒组细胞裂解液中刺突蛋白浓度约为98微克/毫升，是聚乙二醇化脂质纳米粒组的四倍以上；在人表皮生长因子受体2阴性MDA-MB-231细胞中转染后，棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒组和聚乙二醇化脂质纳米粒组刺突蛋白浓度相当，均低于脂质体转染试剂组的三分之一；流式细胞术和免疫荧光检测显示，棕榈酰化纳米抗体表面暴露量越高，SK-BR-3细胞对棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒的摄取越多，SK-BR-3细胞膜表面刺突蛋白表达水平越高，而人表皮生长因子受体2阴性MDA-MB-231细胞对棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒的内化效率很低，无棕榈酰化纳米抗体的聚乙二醇化脂质纳米粒也几乎不被SK-BR-3细胞内化，证明棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒的人表皮生长因子受体2靶向特异性。体外杀伤实验显示，效靶比为5:1共孵育48小时后，刺突蛋白激活的CD3+T细胞对刺突蛋白过表达HEK293T细胞的杀伤率达到约71%（n=3，P<0.001），而细胞因子激活的CD3+T细胞和初始T细胞杀伤率均低于20%。

对棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒处理的SK-BR-3细胞，杀伤效率随效靶比升高而提升，上清干扰素-γ水平也随效靶比升高而升高，未处理的SK-BR-3细胞没有观察到明显杀伤效应，仅在效靶比10:1时对棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒处理的人表皮生长因子受体2阴性MDA-MB-231细胞观察到非常有限的杀伤效应，证明免疫杀伤的抗原特异性和靶向特异性。实验所用关键产品：赛默飞世尔的新型冠状病毒刺突蛋白夹心酶联免疫吸附试剂盒， Stemcell的CD3+细胞分离试剂盒，其余未明确具体品牌，领域常规使用细胞培养与免疫功能检测类试剂/仪器。

3.4 体内肿瘤靶向与抗肿瘤疗效验证

实验目的：在人表皮生长因子受体2过表达肿瘤荷瘤小鼠模型中，验证棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒的肿瘤靶向能力和体内抗肿瘤疗效。方法细节：建立SK-BR-3皮下移植瘤NSG小鼠模型，将小鼠随机分为四组，分别静脉注射载有刺突蛋白信使核糖核酸的棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒、聚乙二醇化脂质纳米粒、磷酸盐缓冲液，同时每组联合静脉注射单剂量刺突蛋白激活的CD3+T细胞或等量盐水，信使核糖核酸疫苗每五天给药一次，共六次，连续观察28天，每三到四天记录肿瘤体积和小鼠体重，实验结束后收集肿瘤和主要器官进行组织病理学检测。结果解读：活体成像结果显示，棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒可在肿瘤组织富集超过72小时，72小时时肿瘤组织的荧光信号强度是聚乙二醇化脂质纳米粒组的约8倍（n=3，P<0.001），离体组织成像也进一步证实棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒的肿瘤富集效率显著高于聚乙二醇化脂质纳米粒。治疗28天后，磷酸盐缓冲液联合盐水组肿瘤体积约为1300立方毫米，仅注射刺突蛋白-CD3+T细胞组肿瘤体积约为1150立方毫米，与对照组无显著差异，聚乙二醇化脂质纳米粒组和棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒组肿瘤体积较盐水对照组分别缩小36.7%和73.4%（n=3，P<0.01）；棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒组小鼠体重下降约10%，与其他三组相比存在统计学差异。组织病理学检测显示，棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒组肿瘤组织中Ki-67阳性细胞数量显著少于对照组，染色强度明显更弱，提示肿瘤细胞增殖速率降低；原位末端标记染色显示激活的CD3+T细胞诱导大量肿瘤细胞凋亡；心、脾、肺、肾组织均未观察到明显细胞毒性，由于聚乙二醇化脂质纳米粒和棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒都会在肝脏富集，仅在肝脏观察到轻度的肝细胞形态改变，且棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒组改变更明显，但整体不良反应有限，未出现小鼠体重的持续显著下降。实验所用关键产品：文献未提及具体品牌的核心实验产品，领域常规使用荷瘤动物模型构建与体内疗效评价类试剂/仪器。

4. Biomarker 研究及发现成果

本研究中作为靶向递送标志物的是人表皮生长因子受体2，属于肿瘤细胞表面过表达的蛋白类生物标志物，筛选逻辑为：人表皮生长因子受体2是已经过临床验证的多种肿瘤的过表达靶标，已有多款成功的人表皮生长因子受体2靶向治疗药物上市，人表皮生长因子受体2结合配体后可通过受体介导的内吞促进脂质纳米粒内化进入细胞，结合本课题组前期已经成功验证抗人表皮生长因子受体2纳米抗体的稳定性、可靠性和实用性，因此选择人表皮生长因子受体2作为靶向标志物。

验证过程：首先通过体外亲和力实验验证棕榈酰化改造后的纳米抗体仍保留对人表皮生长因子受体2的高亲和力，随后分别在人表皮生长因子受体2过表达细胞和人表皮生长因子受体2阴性细胞中验证棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒的靶向结合、细胞内化和刺突蛋白表达效率，最后在荷瘤小鼠模型中验证棕榈酰化纳米抗体-脂质纳米粒对人表皮生长因子受体2过表达肿瘤的靶向富集能力和治疗效果。特异性数据显示，细胞实验中人表皮生长因子受体2过表达SK-BR-3细胞的刺突蛋白表达量是人表皮生长因子受体2阴性MDA-MB-231细胞的3倍以上，体内实验中肿瘤组织的荧光富集强度是非靶向聚乙二醇化脂质纳米粒组的8倍（n=3，P<0.001），治疗后人表皮生长因子受体2过表达肿瘤的生长抑制率达到73.4%，显著高于非靶向组的36.7%（n=3，P<0.01）。

核心成果：本研究明确人表皮生长因子受体2可作为棕榈酰化纳米抗体修饰无聚乙二醇脂质纳米粒的靶向生物标志物，实现对人表皮生长因子受体2过表达肿瘤的特异性信使核糖核酸递送，本研究首次将棕榈酰化抗人表皮生长因子受体2纳米抗体通过一步自组装整合到无聚乙二醇脂质纳米粒中，实现了高密度的靶标配体展示，利用预存抗刺突蛋白免疫有效杀伤肿瘤细胞，为肿瘤靶向信使核糖核酸疫苗提供了全新的可规模化平台，本研究未评估该标志物作为肿瘤预后生物标志物的价值，其核心应用是作为肿瘤靶向递送的特异性靶标。