评估模块 42 对体外免疫功能的 Aβ 非依赖性效应。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Assessing Aβ‐independent effects of Module 42 on immune function in vitro；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：阿尔茨海默病神经病理学与免疫学。

领域共识：痴呆是全球重大公共卫生挑战，目前全球超5500万人罹患痴呆，预计2030年将增长至7800万。阿尔茨海默病（AD）是痴呆最常见的病因，属于进行性神经退行性疾病，核心病理特征为脑内细胞外β淀粉样蛋白（Aβ）斑块沉积和过度磷酸化tau神经原纤维缠结。近年获批的抗Aβ免疫疗法虽然可有效清除脑内Aβ、延缓认知下降，但临床获益有限，且存在淀粉样蛋白相关影像学异常等不良反应，凸显了仅靶向Aβ的治疗局限性。

领域共识：大规模多组学研究已经证实，除Aβ和tau外，神经炎症、蛋白质稳态改变、神经血管功能异常等多种机制也参与AD病理进程。2022年阿尔茨海默病加速药物合作联盟（AMP-AD）对超过1000例AD、无症状AD和对照的死后脑组织进行了多层组学整合分析，鉴定出多个与AD病理和认知显著相关的新型蛋白共表达网络模块，其中42号模块（M42，又称基质体）与AD病理的相关性最强。M42的蛋白丰度（而非RNA水平）在无症状AD和AD患者死后脑组织中显著升高，且受APOE基因型影响强烈，提示其参与疾病早期进程，多个M42成员在AD患者脑脊液中表达升高，已被提出是AD新型候选生物标志物。现有研究已经证实，多个M42成员可富集于Aβ斑块，部分成员可直接结合Aβ促进其聚集，或通过调控APP加工影响斑块沉积。

现有研究均聚焦于M42对Aβ沉积的调控作用，但M42是否可通过Aβ非依赖途径调控下游细胞应答，尤其是免疫细胞功能，目前尚未见探索，这一研究空白也成为本研究开展的核心出发点。本研究首次系统解析M42蛋白不依赖Aβ的免疫调控功能，为AD病理机制研究和生物标志物开发提供了新的方向。

2. 文献综述解析

作者对现有研究的评述逻辑围绕AD病理研究的发展历程展开，从传统Aβ核心假说，到抗Aβ治疗的临床局限性，再到Aβ之外病理机制的研究进展，进一步引出多组学发现的M42模块，分类阐述M42调控Aβ病理的现有研究证据，最后点出领域研究的不足之处，自然引出本研究的核心科学问题。

现有研究已经明确M42是与AD病理相关性最强的蛋白共表达模块，核心优势在于该结论基于大样本量多组学整合分析得到，且在多种AD小鼠模型中具有保守性，可信度高；现有研究也证实M42成员可通过直接结合Aβ、调控APP加工等多种途径影响Aβ沉积，部分成员已经在脑脊液样本中验证了其作为AD生物标志物的潜力。现有研究的局限性在于，所有研究均围绕M42对Aβ病理的作用展开，完全未探索M42本身对脑内免疫细胞功能的调控作用，而神经炎症是AD病理的重要驱动因素，且M42成员已经被发现富集于斑块相关小胶质细胞，这一方向的研究缺失限制了对M42在AD病理中作用的全面理解。

本研究的创新价值十分明确，首次系统评价了所有M42成员不依赖Aβ的免疫调控作用，突破了现有研究仅关注M42对Aβ沉积影响的局限，明确了多个M42成员对巨噬细胞吞噬功能和细胞内信号的调控效应，填补了M42在AD神经炎症方向的研究空白，为AD病理机制解析和后续治疗靶点开发提供了全新的依据。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标为明确M42模块成员不依赖Aβ对免疫功能的调控作用，核心科学问题是M42模块蛋白是否可通过Aβ之外的途径调控免疫细胞的吞噬功能和细胞内信号，技术路线遵循重组蛋白制备纯化→人诱导多能干细胞分化巨噬细胞→功能筛选→机制验证→排除混杂因素的完整研究闭环，逻辑清晰。

3.1 M42重组蛋白制备与内素质控

实验目的：获得内毒素水平符合要求的M42重组蛋白，用于后续体外免疫功能实验。方法细节：为每个M42蛋白构建编码全长或特定结构域的表达载体，分别通过Sf9昆虫细胞杆状病毒感染或Expi293F细胞瞬时转染以无内毒素方式表达，通过固定金属亲和层析进行初始纯化，肝素结合蛋白进一步采用肝素亲和层析纯化，其余蛋白采用尺寸排阻色谱纯化，必要时补充离子交换层析，无法在实验室获得足够产量和纯度的蛋白则购买商业化产品。采用显色内毒素定量试剂盒检测所有重组蛋白的内毒素水平。结果解读：所有重组蛋白的内毒素水平均低于细胞培养可接受阈值（<1 EU/mL），除多效生长因子（PTN）外其余蛋白内毒素均低于0.1 EU/mL，符合免疫细胞体外实验的要求。实验所用关键产品：Thermo Fisher Scientific的Sf900-II SFM培养基（货号10902096）、FreeStyle 293 Expression Medium（货号12338018）、Pierce Chromogenic Endotoxin Quant Kit（货号A39552）；Novus Biologicals的HTRA1（货号2916-SE-020）；R&D Systems的GPC5（货号2607-G5-050/CF），其余未明确品牌的试剂为领域常规试剂。

3.2 人诱导多能干细胞来源巨噬细胞分化

实验目的：获得稳定的人源功能性巨噬细胞，作为体外免疫功能研究模型。方法细节：使用BIONi010-C人诱导多能干细胞系，在包被基底膜的培养板中维持培养，汇合度达到80%后传代，至少传代两次后通过AggreWell方法形成拟胚体，在添加骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子、干细胞因子的培养基中培养3天，之后转移到低吸附培养板继续培养3天，再转移到明胶包被的培养瓶中，在添加巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素3的培养基中诱导分化，每周收获巨噬细胞前体细胞，继续分化至少7天用于后续实验。结果解读：该分化方案是领域成熟方案，可稳定获得具有正常免疫功能的巨噬细胞，满足后续实验要求（文献未明确提供分化成功率数据，基于方案成熟性推测）。实验所用关键产品：STEMCELL Technologies的mTeSR™1培养基（货号85850）、AggreWell-800培养板（货号34811），其余为领域常规试剂。

3.3 吞噬功能筛选实验

实验目的：从M42模块中筛选出能够调控巨噬细胞吞噬凋亡神经元功能的成员，并明确其作用的底物特异性。方法细节：将SH-SY5Y细胞固定后用pHrodo荧光染料标记，作为吞噬底物；巨噬细胞接种后，分别加入三个浓度（3 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL）的M42蛋白，同时加入标记后的凋亡SH-SY5Y细胞或酵母聚糖颗粒，用活细胞成像系统每小时采集一次图像，连续监测24小时，计算标准化后的吞噬能力，分析M42蛋白对吞噬功能的影响。结果解读：共筛选出5个对凋亡神经元吞噬功能有显著影响的M42蛋白，分别是全长高温需求因子A1（HTRA1，F=6.217，p=0.0142，n=3~4）、肌营养不良蛋白聚糖（DAG1）胞外域（F=12.83，p=0.0013，n=3~4）、跨膜蛋白TMEFF2胞外域（F=9.515，p=0.0107，n=3~4）、中期因子（MDK，F=9.605，p=0.0036，n=3~4）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5（GPC5，F=5.982，p=0.0158，n=3~4）。其中HTRA1、DAG1胞外域、MDK、GPC5会抑制吞噬功能，MDK的剂量依赖性效应最显著，在3 μg/mL浓度下可将吞噬水平降低50%（n=3~4，p<0.01）；TMEFF2胞外域可显著提升吞噬水平，在3 μg/mL浓度下平均提升25%（n=3~4，p<0.05）。进一步验证发现，这5个蛋白对酵母聚糖颗粒的吞噬均无显著影响，说明M42对吞噬的调控是底物依赖性的，仅特异性调控凋亡神经元的吞噬。结果见图1。

实验所用关键产品：Life Technologies的pHrodo iFL Red STP Ester（货号P36011）、Thermo Fisher Scientific的pHrodo标记酵母聚糖生物颗粒（货号P35364），其余为领域常规试剂。

3.4 细胞内钙信号检测

实验目的：明确调控吞噬功能的M42蛋白是否通过影响细胞内钙信号发挥作用。方法细节：巨噬细胞接种后，用钙敏感荧光染料Calcium-6孵育染色，加入不同浓度的M42蛋白后，连续监测5分钟内的荧光强度变化，以曲线下面积量化钙响应强度，分析不同蛋白对钙信号的影响。结果解读：在5个调控吞噬的蛋白中，TMEFF2胞外域（F=4.859，p=0.0479，n=3~6）和MDK（F=5.191，p=0.0117，n=3~6）可诱导显著的钙响应，TMEFF2胞外域的效应呈剂量依赖性，1 μg/mL和3 μg/mL浓度均有显著效应，MDK在100 ng/mL最低浓度下诱导的钙响应最强。HTRA1的效应接近统计学显著性（p=0.0541），DAG1胞外域和GPC5对钙信号无显著影响。此外，本研究还发现另外4个M42蛋白：多配体聚糖4（SDC4）胞外域（F=4.844，p=0.0482，n=3~6）、分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1，F=7.468，p=0.0189，n=3~6）、Spondin-1（SPON1，F=4.509，p=0.0342，n=3~6）、PTN（F=5.845，p=0.0326，n=3~6）也可诱导显著的细胞内钙信号升高。结果见图2。

实验所用关键产品：Molecular devices的Calcium-6染料（货号R8190），其余为领域常规试剂。

3.5 SYK磷酸化检测

实验目的：明确MDK和TMEFF2是否通过TREM2-SYK通路调控吞噬和钙信号。方法细节：巨噬细胞接种分化完成后，用3 μg/mL MDK或TMEFF2胞外域处理1小时，分别设置基线组和TREM2激活抗体刺激组，采用均相时间分辨荧光法检测总SYK和磷酸化SYK水平，分析蛋白对SYK磷酸化的影响。结果解读：基线条件下，TMEFF2胞外域处理可显著降低SYK磷酸化水平（p=0.0138，n=3~5），MDK对基线SYK磷酸化无显著影响（p=0.1191，n=3~5）。TREM2激活抗体刺激可显著提升SYK磷酸化水平（p=0.0131，n=3~5），但MDK和TMEFF2预处理均不影响TREM2诱导的SYK磷酸化，提示MDK和TMEFF2调控免疫功能不依赖TREM2-SYK通路。推测：二者可能通过其他受体信号通路发挥作用，需要后续研究进一步验证。结果见图3。

实验所用关键产品：PerkinElmer的总SYK HTRF试剂盒（货号64SYKTPEG）、磷酸化SYK HTRF试剂盒（货号64SYKY525PEG），其余为领域常规试剂。

3.6 细胞活力检测

实验目的：排除M42蛋白对吞噬和信号的影响是由于改变细胞活力导致的，明确效应的特异性。方法细节：巨噬细胞接种分化完成后，用三个浓度（3 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL）的目标M42蛋白处理24小时，采用CellTiter-Glo发光法检测细胞活力，分析不同蛋白对细胞活力的影响。结果解读：所有检测的M42蛋白在三个测试浓度下对巨噬细胞活力均无显著影响，证实之前观察到的对吞噬功能和钙信号的调控效应，不是由于细胞活力改变导致的，是特异性调控效应。结果见图4。

实验所用关键产品：Promega的CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒（货号G7570），其余为领域常规试剂。

4. Biomarker研究及发现成果

本研究涉及的生物标志物为M42模块的多个分泌成员，该模块最初通过大样本多组学分析从AD死后脑组织中筛选得到，后续研究已经在临床脑脊液样本中验证了多个成员的表达升高，本研究在此基础上进一步明确了这些成员的功能，解析了其不依赖Aβ的免疫调控作用，完善了生物标志物的功能证据。

研究过程中，M42模块的初始筛选基于1000余例AD、无症状AD和对照死后脑组织的基因组、转录组、蛋白质组整合分析得到，明确了M42蛋白丰度与AD病理的强相关性；后续研究通过对AD患者脑脊液样本的验证，发现多个M42成员的水平显著升高，例如SPARC相关模块化钙结合蛋白1（SMOC1）的脑脊液水平可以可靠区分AD病例和非AD对照，其预测Aβ/tau水平的能力已经在多个队列中得到验证，受试者工作特征曲线区分AD与对照的准确性已经得到证实。本研究在这些前期研究基础上，通过体外系统的功能筛选，明确了多个M42成员对免疫功能的调控作用。

核心成果提炼：本研究证实M42模块的多个成员本身可作为胞外信号分子，调控免疫细胞的核心功能，该效应不依赖其对Aβ沉积的调控作用，其中MDK可显著抑制巨噬细胞对凋亡神经元的吞噬，并激活细胞内钙信号，这种效应可通过增加凋亡神经元的累积促进AD病理进展；而TMEFF2胞外域可显著促进吞噬并激活钙信号，提示其对AD可能具有保护作用。此外，HTRA1、DAG1胞外域、GPC5也可特异性调控凋亡神经元的吞噬，提示这些M42成员都参与AD病理的免疫调控过程。本研究所有实验均设置了独立生物学重复和技术重复，统计学显著性标准设定为p<0.05，结果可靠，为AD的病理机制研究提供了新方向，也为AD新型生物标志物和治疗靶点的开发提供了全新的功能依据。