慢性内质网应激触发细胞表面分子伴侣作为急性髓系白血病 CAR 细胞的治疗靶点。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：Chronic ER Stress Triggers Cell‐Surface Chaperones as the Therapeutic Targets of CAR Cells in Acute Myeloid Leukemia；
发表期刊：Advanced Science；影响因子：17.521（2025年）；研究领域：急性髓系白血病（AML）免疫治疗、肿瘤内质网应激与特异性靶点研究

急性髓系白血病是成人发病率最高的急性白血病，其中FLT3-内部串联重复（FLT3-ITD）突变占患者群体的25%-30%，这类患者复发率高、预后极差。现有治疗方案包括传统化疗、FLT3酪氨酸激酶抑制剂（如Quizartinib）、BCL-2抑制剂（如Venetoclax），但仍面临耐药性普遍存在、治疗后复发率高等核心问题。嵌合抗原受体（CAR）细胞治疗在急性淋巴细胞白血病（ALL）中取得突破性疗效，但在AML中的应用受限于缺乏肿瘤特异性靶点——已报道的潜在靶点如CD123、CD33等在正常髓系前体细胞中也有表达，易引发脱靶毒性，导致严重的造血抑制等不良反应。自然杀伤（NK）细胞来源的CAR疗法因具有“现货型”制备潜力、细胞因子释放综合征等毒性更低的优势，成为AML免疫治疗的前沿方向，但同样需要解决特异性靶点匮乏的问题。当前领域未解决的核心问题是：如何识别仅在AML细胞（尤其是携带致癌突变、处于慢性应激状态的恶性细胞）表面表达的特异性靶点，以实现精准、低毒的免疫治疗。本研究针对这一空白，通过多组学分析发现慢性内质网（ER）应激诱导的细胞表面分子伴侣可作为AML的特异性CAR靶点，为AML精准免疫治疗提供新策略。

2. 文献综述解析

作者从AML治疗困境、CAR细胞治疗的靶点瓶颈、肿瘤内质网应激与分子伴侣的作用三个维度对领域现有研究进行综述，系统梳理了AML现有治疗的局限、CAR治疗在AML的挑战，以及分子伴侣在肿瘤中的表达与功能研究现状。

作者首先总结了AML的临床治疗现状：传统化疗完全缓解率有限，FLT3抑制剂虽能改善FLT3-ITD+患者预后，但易出现耐药；BCL-2抑制剂与化疗联用可提高缓解率，但仍无法彻底清除肿瘤细胞。接着，作者综述了CAR细胞治疗在AML的研究进展：CAR-T治疗在ALL中成功，但AML缺乏特异性靶点，已有的靶点因在正常细胞表达导致脱靶毒性，限制了临床应用；CAR-NK作为“现货型”疗法，毒性更低，但同样面临靶点不足的问题。然后，作者梳理了肿瘤内质网应激与分子伴侣的研究：内质网应激是肿瘤细胞应对致癌突变、营养缺乏等应激的适应性反应，分子伴侣如HSP90B1、GRP78等在肿瘤细胞中高表达，部分分子伴侣会转位到细胞表面，参与肿瘤细胞存活、侵袭等过程，但此前研究发现GRP78在AML细胞表面表达的同时，在正常细胞也有表达，无法作为特异性靶点。通过对比现有研究的未解决问题，本文的创新价值凸显：首次发现FLT3-ITD+ AML细胞在慢性内质网应激下，分子伴侣HSP90B1特异性转位到细胞表面，且该蛋白在正常造血细胞表面不表达，可作为AML特异性CAR治疗靶点，解决了AML免疫治疗靶点特异性不足的问题。

3. 研究思路总结与详细解析

本文的研究目标是筛选AML特异性细胞表面靶点，并开发针对该靶点的CAR-NK细胞治疗策略；核心科学问题是FLT3-ITD突变如何诱导内质网应激及分子伴侣转位到细胞表面，以及靶向该分子伴侣的CAR-NK细胞能否特异性清除AML细胞；技术路线为“细胞表面蛋白质组学筛选靶点→突变与应激机制验证→临床样本与单细胞水平验证→CAR-NK细胞构建与体内外功能验证→分子机制解析”的闭环逻辑。

3.1 细胞表面蛋白质组学筛选AML潜在新抗原

实验目的：筛选AML细胞特异性表达的细胞表面蛋白，寻找潜在的免疫治疗新抗原。方法细节：选取FLT3-ITD+ AML细胞系（MV4-11、Molm13）、ALL细胞系（RS4;11）、健康供者外周血单个核细胞（PBMC）为研究对象，采用生物素-XX-苯酚（BxxP）探针结合辣根过氧化物酶（HRP）催化的方法标记细胞表面蛋白，随后裂解细胞，用链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白，通过Orbitrap Exploris 480质谱仪进行蛋白质组学分析；通过对比AML细胞系与对照细胞的蛋白表达谱，筛选差异表达的细胞表面蛋白。结果解读：质谱分析共鉴定到MV4-11、Molm13、RS4;11、PBMC的细胞表面蛋白分别为993、960、925、932种；对比分析发现AML细胞表面显著富集内质网相关分子伴侣蛋白，包括HSP90B1、P4HB等，而这些蛋白在RS4;11和健康PBMC中表达量极低或不表达。产品关联：实验所用关键产品包括BxxP探针（APExBio）、HRP（Sigma）、链霉亲和素磁珠（Pierce）、Orbitrap Exploris 480质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。

3.2 FLT3-ITD突变诱导ER应激与分子伴侣转位验证

实验目的：验证FLT3-ITD突变是否通过诱导内质网应激，导致分子伴侣转位到AML细胞表面。方法细节：首先通过RNA-seq分析MV4-11、Molm13与RS4;11、健康PBMC的基因表达差异，富集内质网应激相关通路；随后用Quizartinib（FLT3抑制剂）处理MV4-11、Molm13细胞，通过RNA-seq和RT-qPCR检测内质网应激基因表达变化，流式细胞术检测细胞表面HSP90B1（csHSP90B1）的表达水平；构建过表达FLT3-ITD的BaF3细胞系，流式细胞术检测csHSP90B1表达；同时用免疫荧光、流式细胞术验证csHSP90B1在AML细胞表面的定位，并检测IRE1α、SRC抑制剂处理后csHSP90B1的表达变化，解析分子机制。结果解读：RNA-seq结果显示FLT3-ITD+ AML细胞中内质网应激相关基因显著上调，与毒胡萝卜素（TG，内质网应激诱导剂）处理的HEK293-T细胞的应激基因表达高度重叠；Quizartinib处理后，AML细胞的内质网应激基因表达下调，csHSP90B1表达显著降低（n=3，P<0.01）；过表达FLT3-ITD的BaF3细胞中csHSP90B1表达显著高于野生型FLT3过表达细胞；免疫荧光和流式细胞术证实csHSP90B1特异性表达于MV4-11、Molm13细胞表面，RS4;11细胞无表达；IRE1α或SRC抑制剂处理后，csHSP90B1表达降低，提示FLT3-ITD通过IRE1α-SRC通路诱导分子伴侣转位。产品关联：实验所用关键产品包括Quizartinib（Selleckchem）、毒胡萝卜素（TG，Sigma）、IRE1α抑制剂（HY-18509，MCE）、SRC抑制剂（HY-101053，MCE）、流式细胞仪（BD FACSAria）、HSP90B1抗体（Millipore MABT196、Proteintech 14700-1-AP）。

3.3 原发性AML细胞的ER应激与csHSP90B1表达验证

实验目的：验证临床原发性AML细胞中是否存在慢性内质网应激及csHSP90B1的特异性表达。方法细节：收集FLT3-ITD+ AML患者的骨髓样本，通过RNA-seq分析内质网应激相关基因的表达；重新分析公共数据库中131例FLT3-ITD+ AML患者的转录组数据，验证内质网应激基因的富集；采用流式细胞术检测15例AML患者（含4例FLT3-ITD+）和3例健康供者骨髓细胞中csHSP90B1的表达，同时检测健康PBMC、CD34+造血干/祖细胞（HSPC）中csHSP90B1的表达。结果解读：RNA-seq结果显示原发性FLT3-ITD+ AML细胞中内质网应激基因显著上调；公共数据库分析证实FLT3-ITD+ AML细胞存在慢性内质网应激；流式细胞术结果显示，15例AML患者样本中均存在csHSP90B1阳性细胞亚群，其中FLT3-ITD+病例的阳性比例更高，而健康供者的骨髓细胞、PBMC、CD34+ HSPC中均未检测到csHSP90B1表达（n=15 vs n=3，P<0.01）。产品关联：实验所用关键产品包括RNA-seq文库构建试剂盒（Vazyme VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit）、流式细胞术抗体（BD Pharmingen的CD34抗体）。

3.4 单细胞转录组分析揭示AML应激亚群

实验目的：在单细胞水平解析AML细胞的内质网应激状态及分子伴侣表达的异质性。方法细节：从GEO数据库（GSE116256）获取4例FLT3-ITD+ AML患者和4例健康供者的骨髓单细胞RNA-seq数据，采用Seurat软件进行UMAP聚类、细胞类型注释；通过差异基因分析、GO富集分析、单基因基因集富集分析（GSEA），筛选存在内质网应激的AML细胞亚群，并分析分子伴侣基因的表达。结果解读：UMAP聚类显示AML样本中存在粒-单核祖细胞、CD16-单核细胞等亚群，这些亚群中内质网应激、氧化应激相关通路显著富集；HSP90B1、P4HB等分子伴侣基因在这些应激亚群中高表达，而在健康供者的对应细胞亚群中无明显表达。产品关联：使用生物信息学软件Seurat v4.0.2、SingleR、ClusterProfiler，公共数据库GEO（GSE116256）。

3.5 csHSP90B1-CAR-NK细胞构建与体外功能验证

实验目的：构建靶向csHSP90B1的CAR-NK细胞，并验证其体外特异性杀伤AML细胞的活性及安全性。方法细节：构建包含抗csHSP90B1单链可变片段（scFv）、CD28共刺激域、4-1BB共刺激域、CD3ζ信号域的CAR载体，同时携带T2A自切割肽和GFP标记；通过慢病毒转染NK92细胞，流式细胞术分选GFP阳性细胞，获得稳定表达CAR的NK92细胞；采用凋亡检测（Caspase-3/7染色）、荧光素酶实验检测CAR-NK细胞对MV4-11、Molm13等AML细胞系的杀伤活性；通过脱颗粒实验（CD107a染色）、ELISA检测IFN-γ、Granzyme B的分泌，验证CAR-NK细胞的激活状态；检测CAR-NK细胞对原发性AML细胞的杀伤作用，同时检测对健康PBMC、CD34+ HSPC的毒性；此外，检测CAR-NK细胞与低剂量Venetoclax联用的杀瘤效果。结果解读：流式细胞术证实CAR-NK细胞稳定表达GFP和CAR分子；凋亡检测显示，CAR-NK细胞与MV4-11细胞共培养6小时后，凋亡率显著高于对照组NK92细胞（n=3，P<0.01）；荧光素酶实验显示，CAR-NK细胞对AML细胞的杀伤具有剂量和时间依赖性，24小时后即使低效靶比（E:T）也能实现近完全裂解；脱颗粒实验显示，CAR-NK细胞与AML细胞共培养后CD107a表达显著上调（n=3，P<0.01），ELISA显示IFN-γ、Granzyme B分泌显著增加（n=3，P<0.01）；CAR-NK细胞对原发性AML细胞具有显著杀伤作用（n=3，P<0.01），但对健康PBMC、CD34+ HSPC无明显毒性；与低剂量Venetoclax联用后，杀瘤活性进一步增强（n=3，P<0.01）。产品关联：实验所用关键产品包括慢病毒载体、NK92细胞系（Procell）、Venetoclax（MCE HY-1553）、Caspase-3/7检测试剂（Thermo Fisher R37111）、ELISA试剂盒（Elabscience E-EL-H1617c、E-EL-H0108c）。

3.6 RNA-seq解析CAR-NK杀伤的分子机制

实验目的：解析csHSP90B1-CAR-NK细胞杀伤AML细胞的分子机制。方法细节：收集共培养6小时后的MV4-11细胞和CAR-NK细胞，提取RNA进行RNA-seq分析；通过差异基因分析、GO富集分析、KEGG通路分析，分别解析AML细胞和CAR-NK细胞的基因表达变化及通路激活情况。结果解读：RNA-seq结果显示，共培养后的MV4-11细胞中凋亡相关基因显著上调，致癌基因Myc、FLT3及抗凋亡基因Bcl2显著下调，PD-L1表达上调；CAR-NK细胞中Granzyme B（GZMB）显著上调，免疫激活、NK细胞介导的细胞毒性通路显著富集；GO和KEGG分析显示，AML细胞中凋亡、细胞死亡通路激活，CAR-NK细胞中免疫效应细胞活化、细胞毒性通路激活。产品关联：实验所用关键产品包括TRIzol试剂（Life Technologies）、MGISEQ-2000测序平台（MGI）、分析软件ClusterProfiler。

3.7 csHSP90B1-CAR-NK细胞体内功能验证

实验目的：验证csHSP90B1-CAR-NK细胞在体内的抗AML活性及安全性。方法细节：采用斑马鱼模型，将MV4-11-mCherry细胞单独或与CAR-NK细胞共注射到斑马鱼卵黄囊，观察mCherry荧光变化；采用NSG小鼠模型，注射Molm13-luciferase细胞构建AML异种移植模型，随后注射CAR-NK细胞，通过生物发光成像检测肿瘤负荷，绘制生存曲线；同时，将CAR-NK细胞注射到NSG小鼠，监测体重变化和生存情况，评估安全性。结果解读：斑马鱼模型显示，共注射CAR-NK细胞的斑马鱼中mCherry荧光显著低于单独注射肿瘤细胞的斑马鱼（n=6，P<0.01）；NSG小鼠模型显示，CAR-NK细胞治疗组的肿瘤生物发光信号显著低于对照组（n=5，P<0.01），小鼠生存期显著延长（n=8，P<0.01）；安全性实验显示，CAR-NK细胞注射后小鼠体重无明显下降，与对照组相比生存情况无差异，提示无明显毒性。产品关联：实验所用关键产品包括斑马鱼（Yunnan University实验动物中心）、NSG小鼠（上海模式生物中心）、荧光素酶底物（MCE HY-12591B）、生物发光成像系统（Biospace Lab Photon Imager Optima）。

4. Biomarker研究及发现成果解析

本文发现的Biomarker为细胞表面定位的热休克蛋白90B1（csHSP90B1），属于肿瘤相关新抗原，仅在AML细胞（尤其是FLT3-ITD+等携带致癌突变、处于慢性应激状态的AML细胞）表面表达，正常造血细胞（包括PBMC、CD34+ HSPC）表面无表达。其筛选与验证逻辑为“细胞表面蛋白质组学筛选→细胞系功能验证→临床样本表达验证→单细胞转录组异质性分析→CAR治疗功能验证”的完整链条，为AML的精准诊断和治疗提供了新的特异性靶点。

Biomarker定位：csHSP90B1是内质网分子伴侣HSP90B1在慢性内质网应激下转位到细胞表面的形式，属于肿瘤特异性新抗原，其表达与FLT3-ITD等致癌突变密切相关——致癌突变通过IRE1α-SRC通路诱导内质网应激，进而驱动HSP90B1转位到细胞表面。其筛选逻辑为：通过细胞表面蛋白质组学对比AML细胞系与对照细胞的蛋白表达，筛选出差异表达的ER分子伴侣；随后通过细胞系实验验证其表达与FLT3-ITD突变、内质网应激的相关性；临床样本验证其在原发性AML细胞中的特异性表达；单细胞转录组分析揭示其在AML应激亚群中的表达；最终通过CAR-NK治疗验证其作为治疗靶点的价值。

研究过程详述：csHSP90B1的来源为AML细胞系（MV4-11、Molm13）和原发性AML患者的骨髓细胞；验证方法包括：流式细胞术检测细胞表面表达（在15例AML患者样本中均检测到阳性亚群，FLT3-ITD+病例阳性比例更高）、免疫荧光验证细胞表面定位、RNA-seq验证其表达与内质网应激基因的相关性、功能实验验证FLT3抑制剂处理后表达下调；特异性方面，健康供者的PBMC、骨髓细胞、CD34+ HSPC中均未检测到csHSP90B1表达，而AML细胞中特异性表达；敏感性方面，流式细胞术定量分析显示，AML患者样本中csHSP90B1阳性细胞比例显著高于健康供者（n=15 vs n=3，P<0.01）。

核心成果提炼：csHSP90B1作为AML的特异性Biomarker，其功能关联为：FLT3-ITD等致癌突变通过IRE1α-SRC通路诱导内质网应激，导致HSP90B1转位到细胞表面，参与AML细胞的存活与应激适应；创新性在于首次发现csHSP90B1是AML特异性细胞表面靶点，解决了AML免疫治疗靶点特异性不足的问题；作为治疗靶点，靶向csHSP90B1的CAR-NK细胞可特异性清除AML细胞，且与Venetoclax联用可增强疗效，体内实验显示显著抑制肿瘤生长、延长生存期，同时无明显脱靶毒性。此外，csHSP90B1的表达不受Venetoclax影响，提示联用方案可应对Venetoclax耐药的AML细胞。