重组大比带状病毒作为二价疫苗平台，可诱导针对细胞内病原体和癌症的保护性免疫。

1. 领域背景与文献

文献英文标题：RecombinantDabie bandavirusas a bivalent vaccine platform inducing protective immunity against intracellular pathogens and cancer；

发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：新发传染病防控，病毒载体疫苗研发。

大别山病毒又称发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV），是一种新发蜱传病原体，可引起人类发热伴血小板减少综合征，该病在东亚地区流行，病死率为10%~30%，2017年被世界卫生组织列为优先病原体，目前尚无获批的疫苗或特异性抗病毒治疗手段。领域共识：SFTSV属于白纤病毒科班病毒属，为分节段负链单股RNA病毒，其非结构蛋白NSs是毒力因子，通过抑制I型干扰素应答介导免疫逃逸，因此NSs是疫苗开发中基因减毒的理想靶点。此前已有多种技术路线的SFTSV疫苗被开发，包括蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、全灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒载体疫苗和mRNA疫苗，但多数研究聚焦于诱导中和抗体的全长糖蛋白，细胞免疫应答诱导能力有限，也尚未开发出可同时针对SFTSV和其他疾病的二价疫苗平台。现有研究已证实NSs基因缺失或突变可获得减毒且保持免疫原性的病毒株，在老年雪貂模型中可提供完全保护，证明了减毒活SFTSV疫苗的可行性，但尚未有研究将该骨架开发为可插入外源抗原的通用二价疫苗平台，也未验证其作为载体对抗胞内病原体和癌症的能力。本研究针对这一研究空白，开发了NSs基因缺失并可插入外源抗原的重组SFTSV二价疫苗平台，在小鼠和非人灵长类模型中验证了其安全性、免疫原性和保护效果，明确了其针对SFTSV、胞内病原体和癌症的保护能力，为下一代疫苗平台开发提供了新的方向。

2. 文献综述解析

作者按现有SFTSV疫苗的技术路线分类对现有研究进行评述，梳理了不同平台的优势与局限性。mRNA疫苗编码SFTSV糖蛋白，可在小鼠致死攻毒模型中产生高中和滴度和完全保护，优势在于设计快速、生产可规模化，局限性在于依赖脂质纳米颗粒递送，反应原性高于蛋白疫苗，冷链要求严格，在大动物模型中的免疫持久性和交叉基因型保护广度尚未得到验证。蛋白亚单位疫苗是目前安全性最高、最易规模化的平台，搭配强佐剂或异源初免-加强方案可获得可靠的保护效果，局限性在于通常需要多剂次免疫或强佐剂才能达到基因平台水平的细胞免疫应答。病毒载体平台包括腺病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、狂犬病毒载体等，其中表达SFTSV糖蛋白的重组水疱性口炎病毒和重组牛痘病毒可保护动物免于致死感染，重组水疱性口炎病毒还可对同属近缘病毒提供交叉保护，优势在于免疫原性强，局限性在于部分研究未验证细胞免疫应答，预存免疫会降低载体效果，部分载体可引起轻度全身反应和短暂病毒血症，所有病毒载体平台都存在基因组整合、重组、毒力回复等安全性顾虑。减毒活SFTSV疫苗尤其是NSs缺失变体，优势在于可展示完整的病毒抗原谱，不存在预存载体免疫问题，免疫原性强，可提供跨基因型保护，还可改造表达外源抗原，局限性在于SFTSV本身为高致病性病原体，临床转化需要严格的生物安全控制和全面的非临床安全性验证。通过对比现有研究的不足，本研究的创新价值在于首次将NSs缺失的减毒SFTSV改造为可插入外源抗原的二价疫苗平台，明确了该平台可同时诱导针对SFTSV和外源抗原的保护性免疫，首次在动物模型中验证了该平台对抗胞内病原体和癌症的保护效果，填补了该方向的研究空白。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究的整体研究目标为开发基于减毒重组SFTSV的二价疫苗平台，核心科学问题是NSs缺失的重组SFTSV能否保持减毒特性，有效诱导免疫应答，同时作为载体表达外源抗原，诱导针对外源抗原的保护性免疫，实现对抗SFTSV、胞内病原体和癌症的三重保护，技术路线为“重组病毒构建→体外特性验证→体内免疫原性验证→SFTSV保护效果验证→外源抗原保护效果验证”的完整闭环。

3.1 重组减毒SFTSV的构建与体外减毒验证

实验目的：构建NSs基因缺失、可表达外源抗原的重组SFTSV，验证其减毒特性。方法细节：基于SFTSV HB29株（基因型D）反向遗传系统，删除S片段的NSs基因，分别插入增强型绿色荧光蛋白、卵清蛋白、恙虫病东方体特异性抗原TSA56，再将重组病毒与东亚流行的基因型B野毒株JJ进行基因重配，获得L、M片段来自JJ株，重组S片段来自HB29株的重配病毒，在Vero E6细胞中拯救病毒后，在Vero E6、BJAB细胞，以及野生型和干扰素α受体1敲除小鼠的骨髓来源树突状细胞、骨髓来源巨噬细胞中检测复制动力学，通过免疫荧光和免疫印迹验证蛋白表达。结果解读：免疫荧光和免疫印迹证实病毒核蛋白和外源蛋白均成功表达，复制动力学检测显示，缺失NSs的重组病毒在I型干扰素缺陷的Vero E6细胞中复制动力学与野生型接近，仅效率略低；在I型干扰素功能完整的BJAB细胞和野生型小鼠骨髓来源巨噬细胞中，重组病毒复制从感染后24小时开始下降，显著低于野生型病毒，证明其在完整干扰素应答存在时实现了有效减毒；在干扰素α受体1敲除小鼠的细胞中，重组病毒和野生型病毒复制效率无显著差异，符合减毒设计预期。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用反向遗传构建试剂、细胞培养试剂与病毒检测试剂。

3.2 重组SFTSV激活专职抗原呈递细胞的能力验证

实验目的：验证重组SFTSV能否有效激活专职抗原呈递细胞，为诱导适应性免疫奠定基础。方法细节：用野生型小鼠的骨髓来源树突状细胞、骨髓来源巨噬细胞、B细胞分别感染野生型SFTSV或重组ΔNSs-OVA病毒，感染后24小时通过流式细胞术检测共刺激分子和主要组织相容性复合体分子的表达；通过膜联蛋白V和7-氨基放线菌素D染色检测细胞凋亡；对感染后的骨髓来源树突状细胞分选得到GFP阳性感染细胞和GFP阴性未感染细胞，进行转录组测序，分析差异表达基因和通路富集。结果解读：ΔNSs-OVA感染细胞表面CD86和主要组织相容性复合体I类分子表达显著高于模拟感染对照（p<0.05，n=3），激活标志物的表达水平与野生型SFTSV相当甚至更高，证明NSs基因缺失不会损害病毒激活专职抗原呈递细胞的能力，反而可能增强激活效果。凋亡检测显示，野生型和重组病毒诱导的细胞死亡水平相当，GFP阳性感染细胞的凋亡比例显著低于GFP阴性未感染细胞，且GFP阳性感染细胞的所有激活标志物表达均显著高于GFP阴性细胞（p<0.05，n=3）。转录组分析显示，三组细胞转录谱明显分离，GFP阳性感染细胞中抗原呈递、抗病毒激活相关基因显著富集，同时凋亡通路存在促凋亡和抗凋亡基因的双向调控，保持了细胞的抗原呈递功能。

实验所用关键产品：文献未明确标注特殊产品品牌，领域常规使用流式染色抗体、转录组测序试剂。

3.3 重组SFTSV体内免疫原性与安全性验证

实验目的：在小鼠和非人灵长类模型中验证重组SFTSV的免疫原性和体内安全性。方法细节：野生型小鼠分两组肌肉注射两次免疫，剂量分别为10^4焦点形成单位/只和10^6焦点形成单位/只，间隔2周，免疫后检测不同组织的病毒载量、血清生化指标，加强免疫后检测抗原特异性抗体和T细胞应答；2只恒河猴肌肉注射两次免疫，每次10^6焦点形成单位/只，间隔4周，监测体温、血常规、血清生化，检测免疫后的抗体和T细胞应答。结果解读：小鼠免疫后，脾脏中未检测到病毒RNA，肺中未检测到病毒RNA，仅1只小鼠肝脏中短暂检测到3.1×10^2拷贝/微克总RNA，引流淋巴结中可检测到约10^3拷贝/微克总RNA直至免疫后6天，血清生化未检测到系统性炎症或器官损伤，证明减毒病毒体内安全性良好。加强免疫后1周，核蛋白抗原刺激下，脾细胞中分泌干扰素γ的CD4+和CD8+T细胞频率呈剂量依赖性显著升高，针对核蛋白和糖蛋白的特异性IgG以及中和抗体也呈剂量依赖性显著升高（p<0.05，n=4）。恒河猴免疫后仅1只出现短暂病毒血症，1-2天内出现轻微体温升高和一过性血小板减少，血清炎症反应轻微，加强免疫后核蛋白特异性抗体、中和抗体和T细胞应答均显著升高（n=2），证明重组SFTSV在小鼠和非人灵长类体内均可诱导强烈的抗原特异性体液和细胞免疫，且无显著不良反应。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用酶联免疫吸附试验、酶联免疫斑点试验试剂。

3.4 重组SFTSV对SFTSV的长期保护效果验证

实验目的：验证免疫后对SFTSV致死攻毒的保护效果以及免疫记忆的持久性。方法细节：用不同剂量的ΔNSs-GFP免疫对SFTSV高度易感的干扰素α受体1敲除小鼠，2周后用野生型SFTSV攻毒，观察体重和生存情况，检测病毒载量和血小板计数；在免疫后3、6、9、12个月分别进行攻毒，检测不同时间点的抗体和T细胞水平，同时将免疫小鼠的血清被动转移给 naive小鼠，攻毒后观察保护效果。结果解读：单次低剂量（10^1焦点形成单位/只）免疫即可让所有小鼠在致死攻毒后存活，对基因型B、D、A三种不同基因型的SFTSV均可提供完全交叉保护；免疫后12个月攻毒，所有免疫小鼠均存活，无明显体重下降，脾脏病毒载量显著低于对照，且免疫小鼠未发生血小板减少（p<0.001，n=5）；血清学检测显示，中和抗体水平在免疫后12个月仍维持显著升高（p<0.001，n=4）。被动转移实验显示，免疫血清可让naive小鼠对致死攻毒产生显著抗性，低剂量攻毒可提供60%的保护，高剂量攻毒仅能延迟死亡，证明中和抗体是保护的核心，同时细胞免疫也发挥了补充作用。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用动物感染模型相关试剂。

3.5 携带外源抗原的重组SFTSV保护效果验证

实验目的：验证重组SFTSV作为二价载体，表达外源抗原后能否诱导针对癌症和胞内病原体的保护性免疫。方法细节：ΔNSs-OVA感染抗原呈递细胞后，流式检测主要组织相容性复合体I类分子对OVA肽的呈递能力，将感染后的抗原呈递细胞与OVA特异性OT-I T细胞共培养，检测T细胞增殖；小鼠免疫ΔNSs-OVA后，接种表达OVA的B16黑色素瘤细胞，监测肿瘤生长；构建表达恙虫病东方体外膜抗原TSA56的ΔNSs-TSA56，免疫小鼠后用恙虫病东方体致死攻毒，检测生存率和组织细菌载量。结果解读：ΔNSs-OVA感染的抗原呈递细胞尤其是树突状细胞，表面OVA肽-主要组织相容性复合体I复合物表达显著高于对照（p<0.05，n=3），可有效诱导OVA特异性T细胞体外增殖；体内免疫后，脾脏中OVA特异性CD4+和CD8+T细胞频率显著升高，黑色素瘤攻毒后肿瘤生长被显著抑制（p<0.05，n=6）。ΔNSs-TSA56免疫后，脾脏中TSA56特异性CD4+和CD8+T细胞频率显著高于两个对照组（p<0.05，n=4），致死攻毒后生存率显著高于对照组，肺脏细菌载量显著降低（p<0.01，n=5），保护效果与TSA56亚单位疫苗相当，证明重组SFTSV载体可有效呈递外源抗原，诱导强烈的抗原特异性T细胞应答，对癌症和胞内病原体均具有保护效果。

实验所用关键产品：文献未提及具体实验产品，领域常规使用肿瘤细胞培养试剂、胞内病原体培养试剂。

4. Biomarker 研究及发现成果

本研究为重组病毒二价疫苗平台的开发研究，未开展新型生物标志物的筛选、验证及临床转化相关工作，研究中用于评价疫苗免疫原性与保护效果的指标均为疫苗学领域公认的常规通用指标，包括中和抗体滴度、抗原特异性T细胞频率等，本研究未发现新的特异性疾病诊断或预后生物标志物。