利用葡聚糖诱导的训练免疫对巨噬细胞进行表观遗传和代谢重编程，以增强结直肠癌疫苗反应。
Leveraging glucan-induced trained immunity for the epigenetic and metabolic rewiring of macrophages to enhance colorectal cancer vaccine response.
1. 领域背景与文献
发表期刊：Nature Communications；影响因子：17.6（2025年数据）；研究领域：结直肠癌免疫治疗、训练免疫、肿瘤微环境调控
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因，2020年新增病例约190万，死亡近100万。尽管传统治疗（化疗、放疗、手术）在部分患者中有效，但复发率高达70-75%，尤其是晚期病例。免疫检查点抑制剂（ICI）在错配修复缺陷（dMMR）或高微卫星不稳定性（MSI-H）CRC中显示出显著疗效，但这类患者仅占所有病例的15%，而占85%的错配修复正常（pMMR）或低微卫星不稳定性（MSI-L）CRC患者对ICI反应不佳。为解决这一未满足的医疗需求，多种癌症疫苗被设计用于增强主动抗肿瘤T细胞应答，多项临床试验显示出应答率提升，但肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制因素（如调节性T细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、免疫抑制细胞因子）限制了肿瘤清除效率。
训练免疫是固有免疫系统的非特异性记忆反应，涉及固有免疫细胞的表观遗传和代谢重编程，使其在再次暴露于异源刺激时产生增强的应答。此前研究显示训练免疫可保护机体免受细菌、病毒、真菌等病原体的异源挑战，近年来在癌症领域的研究表明，训练免疫可重编程髓样细胞，减少免疫抑制细胞，增强ICI治疗应答，但训练免疫与癌症疫苗联合应用的效果及机制尚未被深入研究。
2. 文献综述解析
本文献综述系统梳理了结直肠癌免疫治疗的现状、训练免疫的研究进展，以及两者结合的潜在价值，指出当前结直肠癌疫苗面临的TME免疫抑制瓶颈，以及训练免疫作为疫苗增强策略的未被探索的方向。
传统CRC免疫治疗中，ICI仅对少数dMMR/MSI-H患者有效，癌症疫苗虽能诱导T细胞应答，但TME中的免疫抑制细胞（如肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞）和细胞因子会削弱肿瘤杀伤效率。训练免疫领域，Netea等首次提出这一概念，后续研究证实其可通过表观遗传和代谢重编程增强固有免疫细胞功能，在癌症中，训练免疫可重编程髓样细胞，减少髓源性抑制细胞，将肿瘤相关巨噬细胞重编程为抗肿瘤表型，从而增强ICI应答，但目前尚未有研究探索训练免疫与癌症疫苗的联合应用及其机制。
本文针对CRC疫苗在pMMR/MSI-L患者中疗效有限的问题，首次提出利用β-葡聚糖诱导的训练免疫增强结直肠癌疫苗（PeptiCrad, PC）的应答，通过重编程巨噬细胞的表观遗传和代谢，构建巨噬细胞-NK细胞-cDC1轴，增强抗肿瘤T细胞应答，为结直肠癌免疫治疗提供了新的策略。
3. 研究思路总结与详细解析
本文的研究目标是验证β-葡聚糖诱导的训练免疫能否增强结直肠癌PC疫苗的疗效，并解析其潜在的表观遗传、代谢及免疫机制。研究采用了从公共数据重分析到体内外实验，再到患者来源类器官验证的多维度策略，逐步揭示训练免疫增强疫苗应答的分子和细胞机制。
3.1 公共单细胞RNA测序数据重分析与初步验证
实验目的：分析β-葡聚糖（WPG）诱导的训练免疫对髓样细胞的影响，验证其是否能增强抗原提呈功能。
方法细节：重分析Geller等发表的胰腺癌模型中PBS或WPG处理小鼠的胰腺组织单细胞RNA测序数据（n=3/组，处理后3天和7天采样）；随后在C57BL/6小鼠中进行体内实验，预处理PBS或WPG后接种携带SIINFEKL肽的PC疫苗，通过流式细胞术分析T细胞亚群和细胞因子表达。
结果解读：公共数据重分析显示，WPG处理小鼠的Chil3+Ly6C+巨噬细胞和单核细胞（簇7、11、12）比例增加，抗原提呈基因（如b2m、h2-k1、ctss）表达上调，Hif1α（训练免疫标志）表达升高，cxcl9和cxcl10（NK和T细胞趋化因子）表达上调。体内实验中，WPG预处理小鼠接种疫苗后，CD8+T细胞中效应记忆（EM）亚群（CD44+CD62L-）比例增加，中央记忆（CM）亚群（CD44+CD62L+）比例减少，且CD8+T细胞分泌的IFN-γ和TNF-α水平显著升高（n=3，P<0.0001），表明训练免疫增强了抗原提呈和T细胞效应功能。
产品关联：实验所用关键产品：WPG（Invivogen, Cat# tlrl-wgp）、流式抗体（BD Biosciences、BioLegend等）。
3.2 训练免疫增强PC疫苗在结直肠癌模型中的疗效（预防和治疗场景）
实验目的：验证训练免疫联合PC疫苗在结直肠癌预防和治疗模型中的疗效，并分析免疫细胞变化。
方法细节：在Balb/c小鼠中建立CT26结直肠癌模型，预防场景：预处理PBS或WPG后接种肿瘤，再接种携带Syl肽的PC疫苗；治疗场景：接种肿瘤后预处理PBS或WPG，再接种PC疫苗。通过测量肿瘤体积、流式细胞术分析TME和脾脏免疫细胞亚群、细胞因子表达。
结果解读：预防场景中，训练免疫联合PC疫苗（Trained+PC）组肿瘤生长抑制最显著（n=8，P<0.0001），单独PC组有中度抑制，单独WPG组无明显效果；治疗场景中，Trained+PC组肿瘤负荷最低，单独PC或WPG组效果有限。TME分析显示，Trained和Trained+PC组单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞浸润增加，肿瘤相关巨噬细胞表达更高的CD80，单核细胞表达更高的CD86，表明其被激活；脾脏分析显示，Trained+PC组CD8+和CD4+T细胞中EM亚群比例增加，Syl肽刺激后IFN-γ和TNF-α分泌显著升高（n=8，P<0.0001），引流淋巴结中cDC1比例增加。
产品关联：实验所用关键产品：Syl肽、PC疫苗（腺病毒载体+肽复合物）。
3.3 训练免疫诱导巨噬细胞的代谢重编程分析
实验目的：解析训练免疫对髓样细胞的代谢重编程机制，验证代谢变化与功能的关联。
方法细节：从Trained+PC和PC组小鼠肿瘤中分离CD11b+细胞，进行代谢组学分析；分离小鼠巨噬细胞，用WPG或PBS刺激18h或2h后，通过Seahorse XFe96分析仪检测氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。
结果解读：代谢组学分析显示，Trained+PC组CD11b+细胞中氨基酸（丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸等）、脂肪酸、肌酸通路关键代谢物（肌酸、磷酸肌酸、肌酐）水平显著升高，糖酵解和Warburg效应相关通路富集。Seahorse实验显示，WPG刺激18h后，巨噬细胞的OCR和ECAR均显著升高（n=7，P<0.05），基础和最大呼吸增加，糖酵解活性增强；刺激2h后，ECAR已显著升高，OCR无明显变化，表明训练免疫快速诱导巨噬细胞向糖酵解转变，且随时间进一步增强。
产品关联：实验所用关键产品：Seahorse XFe96分析仪（Agilent）、代谢组学检测平台（Thermo Vanquish UHPLC+Q-Exactive Orbitrap）。
3.4 单细胞RNA测序解析训练免疫重塑的TME固有免疫 landscape
实验目的：解析Trained+PC处理后TME中固有免疫细胞的变化及细胞间相互作用机制。
方法细节：从Trained+PC和PC组小鼠肿瘤中分离CD11b+细胞，进行单细胞RNA测序分析；通过细胞聚类、差异基因分析、通路富集分析等方法解析细胞亚群变化和功能。
结果解读：单细胞RNA测序显示，Trained+PC组中巨噬细胞、单核细胞、NK细胞亚群（簇0、3、2、7、10、1）比例显著增加；簇2（Chil3+Ly6Chi巨噬细胞）高表达cxcl9、cxcl10、il15等趋化因子和细胞因子，可招募和激活NK细胞；簇1（NK细胞）高表达ccl5、ccl4、xcl1等趋化因子，可招募cDC1；簇13（cDC1）高表达cd80、cd83、h2-Aa等抗原提呈基因，表明其被激活。联合代谢组学和转录组学分析显示，T细胞激活、NK细胞介导的细胞毒性、趋化因子信号通路显著富集，提示存在巨噬细胞-NK-cDC1轴的激活。
产品关联：实验所用关键产品：10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell 3’ Gene Expression v3.1试剂盒。
3.5 肌酸代谢在训练免疫中的功能验证
实验目的：验证肌酸代谢在训练免疫增强疫苗应答中的作用及机制。
方法细节：在体外，用代谢抑制剂（雷帕霉素、抗坏血酸、β-GPA）处理训练后的CD11b+细胞，检测细胞因子和趋化因子分泌；在体内，CT26荷瘤小鼠接受Trained+PC治疗的同时，用β-GPA阻断肌酸摄取，分析肿瘤生长、免疫细胞浸润、表观遗传标记（H3K4me3）表达。
结果解读：体外实验中，β-GPA处理显著降低训练后CD11b+细胞的TNF-α、IL-6、CXCL9、CXCL10分泌（n=3，P<0.001）；体内实验中，β-GPA部分削弱了Trained+PC的肿瘤抑制效果（n=8，P<0.05），但不影响单独WPG或PC的效果；TME分析显示，β-GPA处理不影响巨噬细胞浸润，但显著降低NK细胞浸润（n=6，P<0.01）；免疫荧光染色显示，Trained+PC组巨噬细胞的H3K4me3表达显著升高，β-GPA处理不影响H3K4me3水平，表明肌酸代谢维持训练免疫的效应功能，而非表观遗传编程。
产品关联：实验所用关键产品：β-GPA（Sigma-Aldrich, Cat#G6878）、H3K4me3抗体（Diagnode, C15410003）。
3.6 巨噬细胞-NK-cDC1轴的功能验证
实验目的：验证巨噬细胞-NK-cDC1轴在训练免疫增强疫苗应答中的核心作用。
方法细节：在CT26荷瘤小鼠中，分别或联合耗竭巨噬细胞、NK细胞、CD8+T细胞，分析Trained+PC的肿瘤抑制效果；进行过继转移实验，将PBS或WPG处理的巨噬细胞、NK细胞转移到荷瘤小鼠中，再接种PC疫苗，分析肿瘤生长和免疫应答；通过Transwell实验验证巨噬细胞与NK细胞、NK细胞与DC的趋化相互作用。
结果解读：耗竭巨噬细胞或NK细胞均削弱Trained+PC的肿瘤抑制效果，联合耗竭则完全消除效果；耗竭CD8+T细胞也完全消除效果，表明CD8+T细胞是最终的效应细胞。过继转移实验显示，仅转移训练后的巨噬细胞联合PC疫苗可显著抑制肿瘤生长（n=5，P<0.05），转移训练后的NK细胞无明显效果，表明巨噬细胞是起始细胞。Transwell实验显示，训练后的巨噬细胞通过CXCL9/CXCL10-CXCR3轴招募NK细胞，NK细胞通过CCL5招募DCs。
产品关联：实验所用关键产品：氯膦酸脂质体（巨噬细胞耗竭）、抗Asialo-GM1抗体（NK细胞耗竭）、抗CD8抗体（CD8+T细胞耗竭）。
3.7 训练免疫增强疫苗应答的多模型验证
实验目的：验证训练免疫增强疫苗应答的效果在不同结直肠癌模型中的普适性。
方法细节：在MC38和Colon-26结直肠癌模型中，测试Trained+PC的肿瘤抑制效果，分析免疫细胞浸润和T细胞应答；在Colon-26模型中，验证肌酸代谢的作用。
结果解读：在MC38模型中，Trained+PC组肿瘤生长抑制最显著，部分小鼠实现完全清除，耗竭巨噬细胞或NK细胞削弱效果，β-GPA处理部分削弱效果；在Colon-26模型（APC突变，对PD-1/PD-L1治疗耐药）中，单独疫苗无效果，Trained+PC显著抑制肿瘤生长，TME中巨噬细胞和NK细胞浸润增加，引流淋巴结中cDC1比例增加，脾脏CD8+T细胞EM亚群比例增加，细胞因子分泌升高。
产品关联：实验所用关键产品：MC38、Colon-26细胞系、对应肿瘤特异性肽疫苗。
3.8 人源细胞和患者来源类器官的验证
实验目的：验证训练免疫增强疫苗应答的效果在人源系统中的可转化性。
方法细节：分析公共CRC患者队列中CD206和CXCL9表达与预后的关联；用WPG训练健康供者的PBMCs、单核细胞、巨噬细胞、DCs，检测对腺病毒刺激的细胞因子应答；训练PBMCs后，用CEA肽疫苗刺激，检测抗原特异性T细胞应答；将训练后的PBMCs与CRC患者来源类器官（PDOs）共培养，检测肿瘤杀伤效果。
结果解读：公共队列分析显示，CD206高表达且CXCL9高表达的CRC患者无病生存期更长（n=123，P<0.05）；WPG训练后的人单核细胞、巨噬细胞、DCs对腺病毒刺激的细胞因子应答显著增强；训练后的PBMCs对CEA肽疫苗的IFN-γ应答显著升高（n=3，P<0.05）；训练后的PBMCs与PDOs共培养时，肿瘤杀伤效率显著提高（n=3，P<0.05），且巨噬细胞通过CXCL9/CXCL10-CXCR3轴招募NK细胞。
产品关联：实验所用关键产品：CEA肽疫苗、CRC患者来源类器官、LDH细胞毒性检测试剂盒（CyQUANT, Cat#C20303）。
4. Biomarker研究及发现成果
本文鉴定了训练免疫诱导的关键Biomarker，包括代谢类、表观遗传类、细胞功能类三大类，系统揭示了这些Biomarker在训练免疫增强结直肠癌疫苗应答中的作用及临床相关性，为结直肠癌免疫治疗的机制研究、预后评估和靶点开发提供了新的依据。
本文涉及的Biomarker包括代谢类（肌酸、磷酸肌酸、肌酐）、表观遗传类（H3K4me3）、细胞功能类（趋化因子CXCL9/CXCL10/CCL5、共刺激分子CD80/CD86）。筛选逻辑为：通过代谢组学分析筛选差异代谢物，通过单细胞RNA测序筛选差异表达的趋化因子，通过表观遗传分析筛选训练免疫相关的组蛋白修饰，通过体内外实验验证其功能及临床相关性。其中，代谢类Biomarker来源于肿瘤浸润CD11b+细胞的代谢组学分析，通过Seahorse实验验证其与糖酵解和Warburg效应的关联，通过β-GPA阻断实验验证其在维持训练免疫效应功能中的作用；表观遗传Biomarker H3K4me3来源于训练后巨噬细胞的免疫荧光染色，验证其与训练免疫表观遗传编程的关联；趋化因子CXCL9/CXCL10来源于单细胞RNA测序和ELISA检测，通过Transwell实验验证其在招募NK细胞中的作用；共刺激分子CD80/CD86来源于流式细胞术检测，验证其与巨噬细胞、单核细胞激活的关联。临床相关性方面，公共队列分析显示，CXCL9高表达的CD206+CRC患者预后更好，提示CXCL9可作为CRC免疫治疗的预后Biomarker。
本文鉴定的Biomarker中，CXCL9/CXCL10是训练后巨噬细胞招募NK细胞的关键趋化因子，CCL5是NK细胞招募cDC1的关键趋化因子，肌酸代谢是维持这些趋化因子分泌的重要代谢通路，H3K4me3是训练免疫的表观遗传标记。这些Biomarker不仅揭示了训练免疫增强疫苗应答的机制，还为结直肠癌免疫治疗的预后评估和治疗靶点提供了新的方向。其中，CXCL9在CRC患者中的高表达与更好的无病生存期相关（n=123，P<0.05），肌酸代谢阻断可显著降低训练免疫的效应功能（P<0.01），H3K4me3可作为训练免疫的表观遗传检测标记。