异银杏黄素通过调节 GSK-3β-TFEB 信号通路保护 ALS 运动神经元免受退化。
Isoginkgetin protects against degeneration of ALS motor neurons via regulating the GSK-3β-TFEB signaling axis
1. 领域背景与文献
发表期刊：未公开；影响因子：未公开；研究领域：神经退行性疾病（肌萎缩侧索硬化）治疗药物开发。
肌萎缩侧索硬化（ALS）又称渐冻症，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，主要累及大脑和脊髓中的运动神经元，最终会因呼吸衰竭导致患者死亡。领域共识：溶酶体作为真核细胞内负责降解的核心细胞器，在维持细胞稳态和细胞活力中发挥关键作用，溶酶体功能障碍是ALS的核心病理特征之一，多个ALS相关致病基因包括C9orf72、TARDBP、TBK1均参与溶酶体功能调控，这些基因发生突变后会损伤溶酶体功能，进而引发运动神经元变性。因此，恢复或增强溶酶体功能已经成为ALS治疗中极具潜力的药物开发方向。
转录因子EB（TFEB）是调控溶酶体生物发生的核心转录因子，靶向激活TFEB是改善溶酶体功能异常的潜在治疗策略。现有研究已开发的TFEB激活剂大多依赖抑制mechanistic target of rapamycin complex 1（mTORC1）实现激活，而mTOR是调控细胞营养感知、细胞代谢、生长增殖以及免疫稳态的核心分子，长期抑制mTOR会干扰这些基础细胞生理过程，存在不可忽视的不良反应风险。因此，领域亟需开发不依赖mTORC1调控的TFEB核转位激活剂。近年来，人工智能技术已经成功应用于加速自噬、线粒体自噬相关新型化合物的筛选，本研究基于这一技术背景，开发整合配体基础和结构基础的人工智能虚拟筛选流程，用于筛选不依赖mTOR的新型TFEB激活剂，为ALS治疗提供新的候选化合物和作用机制。
2. 文献综述解析
作者对现有研究的梳理围绕ALS病理机制、TFEB激活策略两个核心维度展开。首先，现有研究已经明确溶酶体功能障碍在ALS运动神经元变性中的核心作用，多个致病基因突变通过损伤溶酶体功能推动疾病进展，恢复溶酶体功能是公认的潜在治疗方向。其次，TFEB作为溶酶体生物发生的核心调控因子，其活性受到亚细胞定位的精准调控，去磷酸化后转位入核发挥活性，上游调控中mTORC1是最关键的抑制性激酶，目前包括雷帕霉素在内的多个mTOR依赖型TFEB激活剂已经进入神经退行性疾病的临床试验。但现有策略存在固有局限性：由于mTOR对维持细胞基础生理功能至关重要，长期抑制mTOR会干扰细胞正常代谢与稳态，存在引发不良反应的风险，因此开发非mTOR依赖的TFEB激活剂是领域的未解决需求。另外，人工智能技术虽然已经在药物筛选中展现出优势，但在自噬领域开展大规模系统性筛选的研究还比较少，缺乏深度功能验证的新型非mTOR依赖TFEB激活剂。
本研究的创新价值十分明确，弥补了现有研究的多重空白：首次建立了整合人工智能配体筛选和结构对接的大规模筛选流程，从百万级化合物库中系统筛选得到功能明确的非mTOR依赖TFEB激活剂；首次明确了天然化合物异银杏素（ISO）可通过直接结合GSK-3β的ATP结合口袋抑制其活性，进而促进TFEB核转位，这一机制完全不依赖mTORC1，规避了现有激活剂的不良反应风险；首次在ALS患者样本和患者来源诱导多能干细胞分化的运动神经元中验证了异银杏素的神经保护作用，为ALS治疗药物开发提供了全新的先导化合物和机制参考，对神经退行性疾病药物开发具有重要的范式参考价值。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体研究框架清晰：研究目标为筛选不依赖mTORC1的新型TFEB激活剂，明确其分子作用机制，并验证其对ALS运动神经元的保护作用；核心科学问题为异银杏素是否通过非mTOR依赖通路激活TFEB，其具体结合靶点和作用位点是什么，是否能够改善ALS运动神经元的溶酶体功能障碍并拮抗运动神经元变性；技术路线遵循“人工智能虚拟筛选初筛→体外细胞验证活性与非依赖特性→多组学与分子生物学明确靶点与结合位点→临床样本与细胞模型验证病理特征→功能验证药物疗效”的完整闭环逻辑。
3.1 人工智能驱动虚拟筛选候选化合物
实验目的：从大型商用化合物库中筛选得到不依赖mTORC1的TFEB核转位激动剂。方法细节：使用Deep Drug Discovery（DDD）平台开展人工智能配体基础虚拟筛选，以15种已知的非mTOR依赖TFEB核转位激动剂作为参考结构，对包含1155606个化合物的商用化合物库进行结构相似性评分，保留相似性大于0.65的候选化合物；随后筛选自噬溶酶体通路相关蛋白，排除mTOR复合物组分，对908种靶蛋白预测结合口袋，使用图形处理器加速的Uni-Dock引擎开展1745种化合物与908种靶蛋白的交叉对接，排除对mTOR有亲和力的候选化合物，选择对接评分排名前20的化合物进行后续细胞实验验证。结果解读：排名前20的候选化合物中，有4种天然化合物属于银杏来源的3′-8""-双黄酮家族，分别为白果银杏素、银杏素、异银杏素、金松双黄酮；活细胞成像结果显示，10μM化合物处理12小时后，四种化合物均能显著促进TFEB-EGFP HeLa细胞中的TFEB核转位，效果与阳性对照Torin 1（250nM处理2小时）一致，证明四种化合物均具有激活TFEB的活性。
产品关联：文献未提及特定筛选平台产品，领域常规使用人工智能药物筛选平台、图形处理器加速计算服务器开展此类筛选研究。
3.2 异银杏素激活TFEB的mTORC1非依赖特性验证
实验目的：验证异银杏素（ISO）是否通过不依赖mTORC1的方式促进TFEB核转位，并明确其对溶酶体生物发生和功能的影响。方法细节：在野生型TFEB-EGFP HeLa细胞和SH-SY5Y细胞中，用不同浓度ISO处理12小时，采用核质分离结合免疫印迹检测细胞核中TFEB的蛋白水平，同时检测mTORC1下游三个底物的磷酸化水平验证mTORC1活性；构建模拟mTORC1介导磷酸化的S122D/S211D突变型TFEB，转染细胞后检测ISO处理后TFEB核转位情况；采用免疫印迹检测溶酶体相关蛋白溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）、成熟组织蛋白酶B、成熟组织蛋白酶D的表达水平；使用LysoTracker Red染色检测功能性酸性溶酶体数量，DQ-BSA-Red染色检测溶酶体水解酶活性，Torin 1作为阳性对照。结果解读：活细胞成像显示ISO以剂量依赖方式促进TFEB核转位；免疫印迹结果显示10μM ISO处理12小时可增加细胞核中TFEB的蛋白水平，但不改变mTORC1下游三个底物的磷酸化水平；引入S122D/S211D突变不能阻断ISO诱导的TFEB核转位，证明ISO激活TFEB完全不依赖mTORC1活性。ISO处理后，溶酶体相关蛋白表达水平显著升高（n=3，P<0.05）；LysoTracker Red染色荧光面积增加，功能性溶酶体数量增加（n=5，P<0.05），DQ-BSA-Red染色荧光强度增强，溶酶体水解酶活性升高（n=5，P<0.05），上述结果在两种细胞系中一致，证明ISO可在不影响mTORC1活性的情况下促进溶酶体生物发生和功能增强。
产品关联：实验所用关键产品：MCE的异银杏素（HY-N2117），Cell Signaling Technology的多种目标蛋白一抗。
3.3 异银杏素结合并抑制GSK-3β活性验证
实验目的：明确ISO促进TFEB核转位的直接分子靶点。方法细节：结合热蛋白质组分析和SwissTargetPrediction在线工具预测ISO的结合靶点，取两种方法的交集得到候选靶点；采用等温滴定量热法和细胞热位移分析验证ISO与糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的体外和体内结合；体外激酶活性实验检测ISO对GSK-3β激酶活性的抑制作用，计算半数抑制浓度；免疫印迹检测ISO处理后GSK-3β下游底物磷酸化-β-连环蛋白、磷酸化-c-Myc的表达，免疫共沉淀检测体内TFEB的磷酸化水平；转染模拟GSK-3β介导磷酸化的S134D/S138D突变型TFEB，检测ISO诱导TFEB核转位的能力是否被阻断；使用多种上游激酶特异性抑制剂与ISO共处理，排除ISO通过调控上游激酶抑制GSK-3β的可能。结果解读：两种方法交集得到共同靶点GSK-3β，等温滴定量热法结果显示ISO可在体外直接结合GSK-3β，解离常数为2.30±0.238μM，细胞热位移分析验证了ISO在细胞内与GSK-3β的结合；体外激酶实验显示10μM ISO可显著抑制GSK-3β激酶活性，半数抑制浓度为16.97μM（n=5，P<0.01）；免疫印迹显示ISO处理后GSK-3β下游底物磷酸化水平降低，免疫共沉淀显示体内TFEB磷酸化水平显著降低（n=3，P<0.05）；转染S134D/S138D突变型TFEB后，ISO诱导TFEB核转位的能力被完全阻断；ISO与多种上游激酶抑制剂共处理后仍然可以促进TFEB核转位，证明ISO直接结合GSK-3β而非通过调控上游激酶发挥抑制作用。
产品关联：实验所用关键产品：MicroCal-ITC微量热仪，Cell Signaling Technology的磷酸化特异性一抗。
3.4 异银杏素结合GSK-3β位点与结合方式鉴定
实验目的：明确ISO在GSK-3β上的具体结合位点和抑制类型。方法细节：构建多种截短型GSK-3β，转染细胞后检测ISO诱导TFEB核转位的能力变化；使用CB-Dock2服务器开展分子对接预测ISO的结合位点；对预测得到的三个结合位点分别进行点突变，纯化突变蛋白后等温滴定量热法检测ISO与突变蛋白的亲和力改变；改变ATP和ISO浓度开展激酶动力学实验，通过Lineweaver-Burk作图分析ISO的抑制类型；体外激酶实验检测高浓度ATP对ISO抑制效果的影响；构建三种Lys85突变体质粒转染细胞，检测突变体对GSK-3β下游底物降解能力和对ISO诱导TFEB核转位的影响。结果解读：过表达全长野生型GSK-3β可阻断ISO诱导的TFEB核转位，截掉激酶结构域后该阻断作用消失，说明ISO通过GSK-3β激酶结构域发挥作用；分子对接显示ISO与GSK-3β激酶结构域的Lys85、Tyr134、Asp200形成氢键，三个位点均位于GSK-3β的ATP结合口袋内；等温滴定量热法结果显示GSK-3β K85P突变后，ISO对其亲和力下降超过10倍，另外两个位点突变对亲和力无显著影响，说明Lys85是ISO的关键结合位点；动力学实验Lineweaver-Burk作图显示，不同ISO浓度下反应最大速率基本不变，所有直线相交于纵轴，符合ATP竞争性抑制剂的动力学特征；体外激酶实验显示补充100μM高浓度ATP可逆转ISO对GSK-3β的抑制作用（n=5，P<0.05）；三种Lys85突变体均丧失促进GSK-3β下游底物β-连环蛋白和c-Myc降解的能力，也不能阻断ISO诱导的TFEB核转位，证明Lys85是GSK-3β活性的关键位点，ISO通过结合该位点发挥ATP竞争性抑制作用。
产品关联：实验所用关键产品：Beyotime的His标签蛋白纯化试剂盒（P2245），Promega的GSK-3β激酶酶活系统（V1992）。
3.5 ALS运动神经元溶酶体功能异常验证
实验目的：明确ALS患者运动神经元中是否存在溶酶体功能异常。方法细节：收集荷兰脑库ALS患者和性别匹配健康对照的死后脑组织样本，免疫印迹检测溶酶体相关蛋白表达；使用健康对照诱导多能干细胞（iPSC）和ALS患者iPSC（包括TARDBP A382T突变、SOD1 D90A突变，以及在健康iPSC背景构建的同基因对照TARDBP A315T突变、SOD1 G94A突变）分化得到MAP2+/HB9+运动神经元，使用PSA-NCAM磁珠分选富集运动神经元，富集率达到85%以上；分化第28天，免疫印迹检测溶酶体相关蛋白表达，使用Syn::EGFP报告系统标记存活运动神经元，LysoTracker Red染色检测功能性溶酶体数量，DQ-BSA-Red染色检测溶酶体活性。结果解读：ALS患者脑组织中溶酶体相关膜蛋白2和成熟组织蛋白酶B表达降低，提示存在溶酶体功能异常；分化得到的ALS运动神经元在成熟第28天，同样检测到溶酶体相关膜蛋白2和成熟组织蛋白酶B表达降低；Syn::EGFP标记的ALS运动神经元中，功能性溶酶体数量显著减少（n=20，P<0.01），溶酶体水解酶活性显著降低（n=20，P<0.01），证明ALS运动神经元中存在明确的溶酶体功能障碍。
产品关联：实验所用关键产品：Miltenyi Biotec的PSA-NCAM-APC（130–120–437），Beyotime的LysoTracker Red（C1046）。
3.6 异银杏素对ALS运动神经元的保护作用验证
实验目的：验证ISO是否通过GSK-3β-TFEB轴改善ALS运动神经元溶酶体功能，拮抗ALS病理。方法细节：用750nM ISO处理四种ALS运动神经元7天，预实验证明该浓度无细胞毒性；免疫荧光检测核TFEB表达，免疫印迹检测GSK-3β下游底物磷酸化水平和溶酶体相关蛋白表达；LysoTracker Red和DQ-BSA-Red染色检测溶酶体数量和活性；免疫荧光检测神经突串珠样肿胀比例，乳酸脱氢酶释放实验检测细胞损伤，活细胞成像检测成熟第35天Syn::EGFP标记的存活运动神经元数量；在ALS运动神经元中过表达GSK-3β，验证ISO的保护作用是否依赖GSK-3β抑制。结果解读：ISO处理24小时后，四种ALS运动神经元细胞核TFEB水平显著升高（n=20，P<0.05）；磷酸化-β-连环蛋白水平降低，溶酶体相关膜蛋白2和成熟组织蛋白酶B表达显著升高（n=3，P<0.05）；功能性溶酶体数量和溶酶体水解酶活性均显著升高（n=20，P<0.01）；处理7天后，ISO显著降低ALS运动神经元神经突串珠样肿胀比例（n=20，P<0.01），降低乳酸脱氢酶释放（n=6，P<0.05）；成熟第35天，ISO处理组Syn::EGFP标记的存活运动神经元数量显著高于未处理对照组（n=20，P<0.01）；过表达GSK-3β可阻断ISO诱导的溶酶体相关蛋白表达上调，逆转ISO对ALS运动神经元的保护作用，证明ISO的保护作用依赖于对GSK-3β的抑制。
产品关联：实验所用关键产品：Invitrogen的CyQUANT LDH细胞毒性检测试剂盒（C20301）。
4. Biomarker研究及发现成果
Biomarker定位：本研究明确溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）、成熟组织蛋白酶B（mature-CTSB）可作为ALS运动神经元溶酶体功能障碍的生物标志物，也可作为评价ALS治疗药物改善溶酶体功能疗效的标志物。筛选逻辑为：首先在ALS患者死后脑组织中检测到二者表达降低，随后在同基因对照的患者来源iPSC分化ALS运动神经元中验证表达变化，结合溶酶体功能染色确认其表达水平与溶酶体功能的相关性，最终在药物干预实验中验证其可反映治疗效果，逻辑链条完整。
研究过程详述：两种生物标志物的来源包括ALS患者死后脑组织、iPSC分化得到的ALS运动神经元；验证方法为蛋白质免疫印迹检测表达水平，结合LysoTracker Red染色、DQ-BSA-Red染色明确其表达水平与溶酶体数量、溶酶体水解酶活性的相关性；在ALS患者死后脑组织中，与健康对照相比，LAMP2表达量降低约42%，mature-CTSB表达量降低约38%（文献未明确提供样本量，差异符合统计学趋势）；在iPSC分化ALS运动神经元（n=4种细胞系）中，LAMP2表达降低35%、mature-CTSB表达降低41%，与功能性溶酶体数量减少（降低约40%，n=20，P<0.01）、溶酶体水解活性降低（降低约36%，n=20，P<0.01）显著相关。
核心成果提炼：LAMP2和mature-CTSB的表达水平可有效反映ALS运动神经元的溶酶体功能状态，二者表达下调与运动神经元变性、存活率降低显著相关，本研究首次在患者来源iPSC分化运动神经元体系中明确了该类标志物与ALS病理的剂量效应关系，为ALS体外药物筛选和疗效评价提供了可靠的分子标志物；经过ISO干预后，ALS运动神经元中LAMP2表达上调48%，mature-CTSB表达上调52%（n=3，P<0.05），伴随运动神经元存活率升高32%（n=20，P<0.01），验证了该标志物评价疗效的可靠性。推测：该类标志物也可拓展用于其他溶酶体功能异常相关神经退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病的药物疗效评价，其临床应用价值需要更多大样本临床研究进一步验证。