Circulating microRNAs as potential biomarkers of physical activity in geriatric patients with HCV

循环微小 RNA 作为 HCV 老年患者体力活动的潜在生物标志物

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Background

Circulating microRNAs have been implicated in a diverse array of biological and pathological phenomena. Their potential utility as noninvasive biomarkers for screening and diagnosing various diseases has been proposed.

Conclusion

MiR-122 and miR-486 expression levels were strongly correlated with physical activity, pain perception, and muscle fatigue biomarkers in HCV-infected patients. These miRNA levels were associated with elevated AST, ALT, fibrosis scores, LDH, CK, and antioxidant status, thus suggesting their potential as biomarkers for disease severity and oxidative stress. However, no correlation was observed with viral load or HCV-RNA expression, thus implying that these miRNAs may impact disease progression and symptoms through host factors, rather than directly affecting viral replication. In summary, the results demonstrated that molecular studies of miR-22 and miR-468 and their associations with PA, pain, adiposity, sex differences, and muscle fatigue, as well as routine biomarkers, could be useful as prognostic nanoninvasive biomarkers, thus providing novel therapeutic targets for CHC infection.

Methods

A total of 150 subjects aged 30 to 66 years were included in this study. The patients were classified as patients with chronic hepatitis C virus (CHC) (n = 110) or healthy controls (n = 40). Real-time polymerase chain reaction (PCR) analyses were performed to determine miR-122 and miR-486 expression. Physical activity (PA), pain score, HCV genotyping, viral overload, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), lactic acid dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), and antioxidant status were also estimated by using prevalidated questionnaires, PCR, and spectrophotometric analyses.

Objective

This study aimed to explore the potential role of the miRNAs miR-122 and miR-486 as molecular biomarkers in the pathogenesis of hepatitis C virus (HCV) infection. Thus, miR-122 and miR-486 were detected in the serum of HCV patients and healthy controls. Moreover, the potential correlations of miR-122 and miR-486 with viral complications, such as physical activity, pain, muscle fatigue, and HCV infection, were identified.

Results

Compared with those in normal controls, significant increases in the serum levels of miR-122 and miR-486 were reported in patients with CHC. In physically active CHC patients, there was a significant correlation between the expression of miRNAs and increased alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), fibrosis scores, and inflammation activity, but no association was reported for hepatitis C virus (HCV) RNA or viral load. Additionally, significant decreases in LDH, CK, GSSG, and pain scores and increases in TAC, GSH, and the GSH/GSSG ratio were reported. Moreover, the expression of miR-122 and miR-486 was positively correlated with changes in body mass index (BMI) and liver fibrosis stage, as well as negatively correlated with sex, PA, TAC, GSH, GSSG, and the GSH/GSSG ratio.

文献解析

1. 领域背景与文献

文献英文标题:Association of miR-122 and miR-486 with physical activity, pain perception, adiposity, and muscle fatigue biomarkers in patients with chronic hepatitis C virus infection;发表期刊:BMC Gastroenterology;影响因子:4.3(2023年);研究领域:慢性丙型肝炎病毒感染与非编码RNA生物标志物研究

慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染全球累及约1.7亿人群,疾病可逐步进展为肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌,是肝相关发病与死亡的重要诱因。领域共识:根除HCV感染可显著降低肝相关疾病的发病率与死亡率,但当前临床缺乏非侵入性生物标志物用于早期评估疾病严重程度、监测宿主相关并发症及指导治疗决策。循环microRNA作为长度约22个核苷酸的非编码RNA,因在胞外囊泡中稳定性高、样本易获取等特点,成为疾病生物标志物研究的热点方向。已知miR-122占肝脏总microRNA的70%以上,是HCV复制的必需因子,也是抗HCV治疗的潜在靶点;miR-486参与肝细胞癌的发生发展及索拉非尼耐药调控。然而,现有研究多聚焦于microRNA与HCV复制、肝癌发生的直接关联,尚未系统性探究其与慢性丙型肝炎(CHC)患者体力活动、疼痛感知、肌肉疲劳等宿主并发症的关联,这一研究空白限制了对HCV感染后宿主病理生理机制的全面理解,也缺乏针对性的非侵入性预后标志物。本研究正是针对这一空白,旨在明确miR-122和miR-486与CHC患者体力活动、氧化应激及肌肉功能的关联,为CHC的预后评估及治疗提供新的生物标志物与靶点。

2. 文献综述解析

作者对领域内现有研究的分类维度主要包括HCV感染的临床影响(生活质量、体力活动与并发症)、microRNA作为生物标志物的功能研究(miR-122、miR-486的已知作用)、体力活动对CHC患者的干预价值三个方向,通过梳理现有研究的结论与局限性,凸显本研究的创新必要性。

现有研究的关键结论显示,miR-122是HCV基因组5"UTR的结合因子,为HCV复制所必需,可作为抗HCV治疗的潜在靶点;miR-486通过靶向FGFR4、EGFR等分子参与肝细胞癌的肿瘤发生及索拉非尼耐药调控,具有肿瘤治疗靶点的潜力。技术方法层面,循环microRNA检测因样本易获取、稳定性高的优势,已成为非侵入性生物标志物研究的常用手段,但现有研究存在明显局限性:多数研究聚焦于microRNA与病毒复制或肝癌发生的直接关联,未涉及CHC患者体力活动、疼痛、肌肉疲劳等宿主相关并发症的机制研究,且缺乏大样本临床队列的系统性分析,无法明确microRNA与疾病严重程度、宿主状态的综合关联。

本研究的创新价值在于首次系统性整合临床队列、血清生物标志物检测与统计分析,探究miR-122和miR-486与CHC患者体力活动、疼痛感知、肌肉疲劳及氧化应激的关联,明确其表达水平与肝酶、纤维化评分等疾病严重程度指标的正相关性,且与病毒载量无显著关联,揭示其通过宿主氧化应激、肌肉功能等因素影响疾病进展的潜在机制,弥补了现有研究在宿主并发症与microRNA关联领域的空白,为CHC的非侵入性预后评估提供了新的候选生物标志物。

3. 研究思路总结与详细解析

本研究采用病例-对照观察性研究设计,核心研究目标是探究miR-122和miR-486与CHC患者体力活动、疼痛感知、肌肉疲劳及氧化应激生物标志物的关联,明确其作为非侵入性预后生物标志物的潜力;核心科学问题是miR-122和miR-486是否通过宿主因素而非直接调控病毒复制影响CHC患者的疾病进展及并发症;技术路线遵循“队列建立→生物标志物检测→相关性分析→机制推断”的闭环逻辑,通过多维度临床指标与microRNA表达的关联分析,验证研究假设。

3.1 研究对象招募与分组

实验目的:建立标准化的病例-对照研究队列,严格控制纳入排除标准以减少混杂因素对结果的干扰,明确体力活动、疼痛等临床指标的评估方法。
方法细节:研究共纳入150名30-66岁受试者,其中慢性HCV感染患者110例,纳入标准为疾病病程超过10年、HCV-RNA阳性、血清转氨酶水平升高,排除合并HIV/HBV感染、肝硬化、肝细胞癌、肥胖(BMI≥25kg/m²)等人群;健康对照40例,为HCV阴性且体力活动评分≥2500 MET分钟/周的受试者。采用全球体力活动问卷(GPAQ)评估受试者的体力活动水平,将CHC患者进一步分为体力活跃组(≥2500 MET分钟/周,n=85)和非活跃组(≤500 MET分钟/周,n=25);采用100mm视觉模拟评分(VAS)评估疼痛强度。采集受试者血清样本,经1400rpm离心1分钟后,-20℃保存备用。
结果解读:CHC患者的体重指数(BMI)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血小板计数及血糖水平显著高于健康对照(P=0.001);体力活跃的CHC患者中,乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平显著低于非活跃组及健康对照,总抗氧化能力(TAC)、还原型谷胱甘肽(GSH)及GSH/GSSG比值显著升高,疼痛评分显著降低(P=0.001或P=0.01),提示体力活动可改善CHC患者的氧化应激状态与疼痛感知。
产品关联:文献未提及具体问卷评估工具的品牌,领域常规使用标准化的GPAQ问卷与VAS评分量表。

3.2 血清microRNA提取与定量检测

实验目的:定量检测CHC患者与健康对照血清中miR-122和miR-486的表达水平,明确组间表达差异及与体力活动的关联。
方法细节:采用TRIzol LS试剂提取血清总RNA,为保证定量准确性,加入化学合成的cel-miR-39作为外参,以血液中富集的miR-16作为内参;使用Applied Biosystems的miR-122和miR-486引物探针,通过ABI 7300实时逆转录PCR(RT-PCR)系统进行定量检测,计算血清样本中miRNA信号与内参、外参的比值作为相对表达量。
结果解读:CHC患者血清中miR-122的表达水平为健康对照的11.5倍(n=110/40,P=0.0001),miR-486的表达水平为健康对照的42.6倍(n=110/40,P=0.0001);体力活跃的CHC患者中,miR-122的表达水平为非活跃组的5.2/9.5倍(n=85/25,P=0.0001),miR-486的表达水平为非活跃组的18.5/31.9倍(n=85/25,P=0.0001),提示体力活动可下调CHC患者血清中miR-122和miR-486的表达。


产品关联:实验所用关键产品:TRIzol LS试剂(Invitrogen)、Applied Biosystems的miR-122和miR-486引物探针、ABI 7300实时PCR系统、Sigma-Aldrich的cel-miR-39。

3.3 临床生化与组织学指标检测

实验目的:检测CHC患者的肝功能、氧化应激、肌肉功能指标及肝组织纤维化程度,分析与miR-122和miR-486表达的相关性,明确其与疾病严重程度的关联。
方法细节:采用Granutest 15酶促试剂盒检测血清肌酸激酶(CK)浓度,Randox的紫外法试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;采用BioVision的比色法试剂盒检测总抗氧化能力(TAC),Cayman Chemical Company的试剂盒检测血清GSH、GSSG水平及GSH/GSSG比值;采用Batts and Ludwig评分系统评估肝炎症程度,Metavir评分系统评估肝纤维化程度,将患者分为早期纤维化(F0-F1)和晚期纤维化(F3-F4)两组。
结果解读:miR-122和miR-486的表达水平与ALT、AST水平呈中度正相关,其中miR-122与ALT的相关系数r=0.98(n=110,P=0.001),与AST的相关系数r=0.78(n=110,P=0.01);miR-486与ALT的相关系数r=0.89(n=110,P=0.001),与AST的相关系数r=0.92(n=110,P=0.01);与肝纤维化评分、炎症活动度呈正相关(P=0.001);晚期纤维化患者的miR-122表达水平为早期纤维化患者的10.8/6.1倍(P=0.001),miR-486表达水平为早期纤维化患者的8.6/5.7倍(P=0.001);但二者与HCV-RNA及病毒载量无显著相关性(r=0.215,P=0.21;r=0.298,P=0.56),提示其表达与疾病严重程度相关,但不直接参与病毒复制调控。


产品关联:实验所用关键产品:Granutest 15酶促试剂盒(EMD Millipore)、Randox的LDH检测试剂盒、BioVision的TAC检测试剂盒、Cayman Chemical Company的谷胱甘肽检测试剂盒。

3.4 相关性统计分析

实验目的:通过多维度统计分析,明确miR-122和miR-486表达与临床指标的综合关联,揭示其与体力活动、疼痛、氧化应激的相互关系。
方法细节:采用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态分布性,对非正态分布数据进行对数转换;采用Student’s t检验、ANOVA分析不同组间的指标差异,Bonferroni多重比较校正统计误差;采用Pearson相关分析及逐步回归分析miR-122、miR-486表达与临床指标的相关性。
结果解读:miR-122和miR-486的表达水平与BMI、血糖水平呈正相关(P=0.001或P=0.01),与性别呈负相关(P=0.002);与肌肉功能指标LDH、CK水平呈正相关,与体力活动评分、TAC、GSH、GSSG及GSH/GSSG比值呈负相关;与疼痛强度呈显著正相关(P=0.001),提示其表达水平可反映CHC患者的肌肉疲劳状态与疼痛感知。
产品关联:文献未提及具体统计分析软件,领域常规使用SPSS、GraphPad Prism等专业统计工具。

4. Biomarker研究及发现成果解析

本研究鉴定的血清miR-122和miR-486是慢性丙型肝炎病毒感染患者疾病严重程度及宿主状态的潜在非侵入性生物标志物,通过病例-对照队列的多维度验证,明确其与体力活动、疼痛、氧化应激及纤维化程度的关联,具有重要的预后评估与治疗靶点价值。

Biomarker定位方面,miR-122和miR-486属于循环非编码RNA生物标志物,其筛选与验证逻辑遵循“差异表达检测→临床指标关联→疾病严重程度验证”的完整链条:首先通过病例-对照研究明确CHC患者与健康对照的表达差异,再分析与体力活动、疼痛等宿主指标的相关性,最后验证与肝纤维化、肝酶等疾病严重程度指标的关联,并排除与病毒载量的相关性,确保其作为宿主状态生物标志物的特异性。

研究过程中,Biomarker的来源为CHC患者及健康对照的外周血清样本,验证方法采用实时RT-PCR定量检测,以miR-16(内参)和cel-miR-39(外参)校正定量误差,保证检测结果的可靠性。特异性与敏感性方面,CHC患者中miR-122和miR-486的表达水平显著高于健康对照,晚期纤维化患者的表达水平显著高于早期纤维化患者,与ALT、AST、纤维化评分等疾病严重程度指标显著相关,但文献未提供ROC曲线的特异性、敏感性数值(文献未明确提供该数据,基于图表趋势推测)。

核心成果提炼显示,miR-122和miR-486可作为CHC患者疾病严重程度及氧化应激状态的非侵入性生物标志物,其表达水平与AST、ALT、纤维化评分、LDH、CK呈正相关,与体力活动评分、TAC、GSH呈负相关;二者与病毒载量及HCV-RNA无显著相关性,提示其通过宿主氧化应激、肌肉功能等因素影响疾病进展及并发症,而非直接调控病毒复制。创新性在于首次揭示miR-122和miR-486与CHC患者体力活动、疼痛感知、肌肉疲劳的关联,为CHC患者的预后评估提供了新的候选生物标志物,也为开发靶向宿主因素的CHC治疗策略提供了方向。统计学结果显示,CHC患者中miR-122表达水平升高11.5倍(n=110,P=0.0001),miR-486表达水平升高42.6倍(n=110,P=0.0001),与肝纤维化评分呈正相关(P=0.001),与疼痛强度呈正相关(P=0.001)。

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