一个细胞里测出几千种蛋白：单细胞蛋白组正在补上转录组测不到的那一半

导语
单细胞转录组已经把“有哪些细胞类型”回答得相当清楚，但临床上真正决定表型的往往是蛋白：受体有没有表达在膜上、信号通路有没有被磷酸化激活、分泌的细胞因子有没有真的释放。过去五年，单细胞蛋白组一直卡在两个数字上——每个细胞能测到多少蛋白、一天能测多少个细胞。2026 年，这两个数字同时被推高了一个量级。

一、转录组解释不了的那部分

中心法则常被简化成 DNA→RNA→蛋白，但中间隔着翻译效率、蛋白降解速率、亚细胞定位和翻译后修饰。多项系统性的跨平台比较都显示，同一基因的 mRNA 丰度与其蛋白丰度之间只呈中等程度相关——换句话说，用转录组推断蛋白，误差足以改变结论。

对免疫学尤其如此。一个 T 细胞是不是“耗竭”，转录组能看到 TOX、PDCD1 的升高；但要判断它还能不能杀伤，需要看颗粒酶 B 与穿孔素的蛋白水平、看表面 CD3 是否被内吞、看线粒体蛋白是否被选择性降解。这些都在蛋白层面。

现有的单细胞蛋白技术各有盲区：流式细胞术与质谱流式（CyTOF）都依赖抗体 panel，一次能看的靶标从十几个到四五十个，且必须事先知道要看什么；成像类方法受限于通道数与空间分辨率。单细胞蛋白组走的是另一条路——不预设靶标，直接测蛋白质组。

二、真正的瓶颈不是质谱，是样本损失

一个哺乳动物细胞的蛋白总量在皮克量级，摊到上万个蛋白上，每种蛋白只有拷贝数量级的差异。从取样、裂解、还原烷基化、酶切到上机，每一步都在丢东西：管壁吸附、纳升体积的移液误差、试剂带来的背景峰，都会把最弱的那部分信号吃掉。

所以这条技术路线的核心突破，大多发生在“样本前处理”而不是“质谱仪”。目前主流做法是在玻璃片上用液滴做单细胞分选、标记与酶切，把整个反应压在一个自动化程度很高的小体积体系里，尽量减少转移与损失。这一步做不好，后面用再贵的仪器也只能测到高丰度蛋白。

三、三条把通量推上去的路

第一条是质谱域的多重化。plexDIA 的思路是用非等压的质量标签（mTRAQ、二甲基、PSMtags 等）给不同样本打上不同的质荷比偏移，让多个单细胞样本在同一次液相色谱—质谱运行中被区分。因为标签不是等压的，定量可以在 MS1 与 MS2 两个层面同时做，避免了等压标签共隔离带来的比值压缩。用 5 分钟梯度，plexDIA 可以在单个细胞里定量约 1,000 种蛋白；换成 9 重 PSMtags 与 30 分钟梯度，每个样本可定量超过 3,000 种蛋白，双柱系统下每天可处理上千个单细胞级别的样本而基本不损失深度。

第二条是时间域的多重化。timePlex 把多个样本的洗脱梯度错开重叠，因为时间维度与质量维度正交，可以在不增加质谱扫描负担的前提下再乘一层样本数。3 重 timePlex 叠加 9 重 plexDIA 就是 27 重，每天可处理超过 500 个样本，并指向每天上千个细胞的目标。

第三条是仪器与采集方式。Orbitrap Astral 这类高分辨、高扫描速度的仪器，在免标记条件下单个细胞即可鉴定约 5,000 种蛋白；timsTOF 平台的 PASEF 结合 DIA，则靠离子淌度把共洗脱干扰压下去。与之配套的还有数据处理：高多重化会产生高度重叠的谱图，需要专门的解卷积与定量模型——开源工具 JMod 在测试中实现了 32 倍动态范围内的准确定量，单次运行定量超过 70 万个前体离子。

四、现在能回答什么生物学问题

最直接的是蛋白异构体。同一基因的不同剪接产物，在转录组层面常常难以区分，在蛋白层面却可以通过特征肽段分开。2026 年公布的一组帕金森病脑组织数据里，ALDH9A1 与 GNAI2 的异构体比例在患者与对照之间存在差异，而这种差异在总丰度上是看不到的。

其次是修饰。磷酸化蛋白组在单细胞层面的可行性已经在多项工作中验证，这让“某个通路在多少个细胞里被激活”从推测变成测量。

第三是细胞类型的定量差异。同一批帕金森病与对照脑组织中，单细胞蛋白组在每个样本里定量到 10,426 种蛋白，鉴定出 259 个显著差异蛋白（q<0.05），其中包括酪氨酸羟化酶（TH）与多巴脱羧酶（DDC）——这两个都是多巴胺合成的关键酶，也是帕金森病病理的核心读数。这类结果在批量蛋白组里会被细胞组成的差异掩盖，只有在单细胞层面才能归因到具体的神经元或胶质细胞。

对免疫学来说，最有价值的场景是“表面标志 + 全蛋白组”同时读：用流式或质谱流式先把细胞群定下来，再用单细胞蛋白组看这群细胞内部的蛋白状态差异。这比在几十个抗体的 panel 里反复加通道，拓展空间大得多。

五、四个还没解决的现实约束

• 深度与通量的权衡仍然存在。要在单个细胞里测到几千种蛋白，通常需要更长的梯度与更高的载样量，通量就上不去；反过来，追求每天上千个细胞，单细胞深度往往回落到千种蛋白量级。
• 缺失值。单细胞蛋白组的数据缺失不是随机的，低丰度蛋白在部分细胞里测不到，会系统性地偏向高表达细胞。处理方式（填补、过滤、混合模型）会直接影响生物学结论。
• 成本与门槛。高分辨质谱、纳升液相、自动化样本前处理，三件套的投入以百万计；一个课题的样本量往往只有几十个细胞级别，统计功效有限。
• 没有“参考图谱”。转录组有 HCA 这类人类细胞图谱作为公共底座，蛋白层面还没有对应的单细胞参考。没有参考，就没有统一的细胞类型定义，也没有跨实验室的批间可比性。

对做试剂与耗材的企业，这条链路上的机会很具体：低吸附耗材、纳升移液与芯片、测序级酶与去污剂、以及用于验证的稳定同位素标记肽段，都是被反复消耗且对批间一致性极敏感的物料。

参考资料

1. Slavov N.，《Nature Protocols》，2024 年，单细胞蛋白组样本前处理与 plexDIA 工作流。
2. Derks J. 等，《Nature Methods》，2023 年；Huffman R. G. 等，《Nature Methods》，2023 年，单细胞蛋白组的深度与通量突破。
3. 《Cancer Biology & Medicine》，2026 年 4 月 24 日在线，单细胞蛋白组在肿瘤生物学与精准医学中的进展（综述）。https://www.cancerbiomed.org/content/cbm/early/2026/04/24/j.issn.2095-3941.2025.0464.full.pdf
4. Parallel Squared Technology Institute，2026 年，plexDIA、PSMtags、timePlex 与 JMod 技术说明及帕金森病脑组织单细胞蛋白组数据。https://www.parallelsq.org/
5. 《Nature Methods》，2025—2026 年，Orbitrap Astral 与 timsTOF PASEF 在单细胞蛋白组中的应用比较。https://www.nature.com/nmeth/