导语
细胞治疗的生产讨论，通常集中在载体设计、编辑效率、扩增倍数、放行检测这几件事上。但真正让工艺团队夜里睡不着的，往往是最后一步：把这批活细胞冻起来，运到几百公里外的医院，再在规定时间内复苏、输注。这一步不出现在任何一张“疗效”幻灯片里，却同时决定了两件事——产品能不能跨地域供应，以及病人拿到的细胞还有几分功能。2026 年，围绕这个环节出现了两类进展：一类在配方上把“通用冻存液”拆成按细胞类型定制，另一类干脆给细胞穿上一层可拆解的外壳。
一、同一批细胞，冻过与没冻过不一样
行业里有一个流传很久的默认假设：冻存只是“暂停”，复苏后细胞就恢复原状。这个假设在常规细胞系上大致成立，在免疫细胞上并不成立。
典型配方是含 10% 二甲基亚砜（DMSO，dimethyl sulfoxide，最常用的细胞内冷冻保护剂）加血清或血清替代物。DMSO 能快速穿透细胞膜、降低胞内冰点、减少冰晶损伤，是几十年筛选出来的“黄金标准”。但它同时是细胞毒物：输注时可能引起恶心、呕吐、心血管反应与神经系统症状，临床因此常常限制输注体积，或在输注前洗涤去除。
更关键的是功能层面的损失。2026 年国际细胞与基因治疗学会（ISCT）年会的一项汇总分析（发表于 Cytotherapy）系统列出了 DMSO 配方对不同免疫细胞亚群的影响：NK 与 CAR-NK 复苏后活性下降、细胞毒性减弱，并出现自发脱颗粒（没有遇到靶细胞也释放颗粒）；γδ T 细胞与恒定 NKT 细胞的活化与杀伤能力受损；树突状细胞抗原呈递能力下降；巨噬细胞出现表型漂移，炎性因子分泌谱改变。
这些不是“活率低几个百分点”的问题，而是“细胞还是那个细胞，行为已经不是那个行为”。
二、冻融损伤发生在两个阶段
把冻融拆开看，损伤集中在两个时点。
降温阶段，细胞内外的水结冰，冰晶的机械作用可以刺破细胞膜；同时，随着胞外先结冰，胞外溶质浓度升高，细胞被“渗透压休克”式地脱水皱缩。冷冻保护剂的作用，就是让水分在结冰前先被置换出去、把冰晶做得更小更均匀。
复温阶段，问题反而更大。微小冰晶在升温过程中会重新长大、合并，这个过程叫冰重结晶（ice recrystallization）。它对膜的破坏往往比降温更严重，也是“慢冻快融”这条操作原则的物理依据。
复苏之后还有第三层损伤：线粒体受损带来的氧化应激、代谢重启失败、以及膜表面蛋白的重新分布。这一层不体现在活率上，却直接影响归巢、识别与杀伤。哺乳动物细胞的麻烦在于，它只有一层磷脂双分子层，没有植物或真菌那样的刚性细胞壁，因此在冰晶与渗透压面前几乎没有结构缓冲。这也解释了为什么“往配方里多加点保护剂”很快会碰到天花板。
三、不同免疫细胞，对冻存的“敏感谱”不同
如果损伤只是物理问题，那么一套配方应该通吃。但真实情况是：不同细胞对同一套配方的耐受度完全不同，而且受损的“表现”也不同。
- NK 与 CAR-NK：最突出的是自发脱颗粒与细胞毒性下降。这类细胞本来靠“随时待命”工作，膜稳定性一旦被破坏，颗粒释放的闸门就松了。
- CAR-T：受损更多体现在信号与扩增。复苏后 TCR 下游信号减弱、IL-2 与 IFN-γ 分泌下降，直接影响体内扩增峰值。
- γδ T 与恒定 NKT：杀伤与细胞因子谱同时受影响，且对渗透压变化格外敏感。
- 树突状细胞：抗原呈递与共刺激分子表达下降，直接影响疫苗类产品的效力。
- 巨噬细胞：极化状态漂移，M1/M2 之间的界限在冻融后变得模糊。
于是“冻存液”这个品类正在被拆细。海藻糖（trehalose，一种双糖，可在膜外形成玻璃态保护层）对 NK 更有效；脯氨酸（proline，一种氨基酸类渗透压保护剂）在无血清条件下对 CAR-T 的 TCR 信号保护更好；抗氧化剂组合对树突状细胞更关键。
四、配方正在细胞类型化
市面上的产品线已经能看出这种分层。BioLife 的 CryoStor 系列按 DMSO 浓度分为 CS2、CS5、CS10（2%、5%、10%），供不同耐受度的细胞选择；Thermo Fisher 的 CTS Synth-a-Freeze 与 Sartorius 的 NutriFreez D10 都是无血清配方，但 DMSO 仍为 10%；无 DMSO 路线则有 FUJIFILM 的 PRIME-XV FreezIS DMSO-Free 与 ZENOGEN 的 STEM-CELLBANKER DMSO Free GMP（后者用丙二醇替代），BioLife 另有一个无 DMSO 的基底 CSB 供定制。
2026 年 10 月，Repligen 完成对 BioLife Solutions 的收购，把这一系列纳入更大的生物工艺平台。这笔交易本身说明了一件事：冻存液不再被当作“耗材”，而是被当作工艺链条上的一个技术资产。
但需要提醒的是，去 DMSO 并不自动等于更好。不同细胞的最优冷冻速率、渗透压保护剂组合、复苏后是否需要洗涤，都必须逐一验证；把 A 细胞的成功配方照搬到 B 细胞，结果常常是活率相当、功能不同。这也是为什么“定制配方”在 CGT 领域是一个真实的商业需求，而不是营销话术。
五、一层可拆的壳，与四条验证要点
2026 年 5 月，合肥综合性国家科学中心大健康研究院刘洪林团队在 Cell Press 旗下 Trends in Biotechnology 发表了一项思路不同的工作：给细胞穿一层“人工细胞壁”。具体做法是把可编程的 DNA 逻辑框架与钙离子交联的海藻酸盐水凝胶结合，在细胞外形成一道物理屏障，既能缓冲冰晶损伤，又能通过 DNA 框架实现细胞类型识别、激活胞内信号促进复苏后增殖；使用后通过酶降解去除，恢复细胞原本的表面状态。研究报告在 Jurkat T 细胞、HeLa 与 PL45 细胞上，无 DMSO 条件下的复苏活性、贴壁效率与增殖能力均优于传统方法。
这条路线目前仍在体外与细胞系层面，距离 GMP 生产还有距离。但它指出了一个方向：与其在配方里不断加减成分，不如在细胞外面加一层“可逆的结构”。
对工艺与质量团队，以下四条比配方选型更值得先做：
- 把冻存前后做成一对数据。 同一批细胞在冻存前、复苏后 0 小时、复苏后 24 小时各做一次功能学检测（杀伤、细胞因子、增殖），而不是只报复苏活率。
- 区分“活”与“能用”。 活率用台盼蓝或流式即可，但自发脱颗粒、极化状态、抗原呈递这些指标，需要流式表型加功能实验才能看出来。
- 复苏后给一段恢复期再评估。 刚复苏的细胞处于应激状态，立即测功能会系统性低估；不同产品的最优恢复时间不同，需要各自标定。
- 把洗涤方式当成工艺参数。 洗与不洗、洗几次、用什么缓冲液，都会改变最终输注产品的渗透压与聚集状态，必须在工艺表征阶段固定下来。
参考资料
- Cytotherapy，2026：面向敏感免疫细胞治疗产品的定制化冻存配方（ISCT 年会摘要，DOI: 10.1016/j.jcyt.2026.102512） https://www.isct-cytotherapy.org/article/S1465-3249(26)00473-1/abstract
- Trends in Biotechnology，2026：用于无 DMSO 冻存与复苏后增殖的 DNA 逻辑人工细胞壁（合肥综合性国家科学中心大健康研究院） https://www.cell.com/trends/biotechnology/home
- 生物工艺供应商产品资料：CryoStor CS2/CS5/CS10 与无 DMSO 基底配方 https://www.biolifesolutions.com/
- 美国食品药品监督管理局：细胞与基因治疗产品生产与质量管理相关指南 https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/biologics-guidances
本文仅作行业技术解读，不构成诊疗建议。