图片来源：wildpixel / iStock / Getty Images Plus
致力于推进作物基因组工程研究的科研人员面临诸多挑战，其中就包括同时引入多种不同的基因组编辑修饰。现代作物育种的核心目标之一是通过将控制优良性状的有利等位基因“堆叠”到单一作物品种中，高效聚合多种优异性状，但现有实现策略耗时长、效率低。
近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞教授团队开发了一套基因组工程平台，可在同一体系内整合基因敲除、精准序列编辑与染色体工程操作，实现作物的多性状堆叠。该技术突破为基于双先导编辑的敲除（twin prime editing-mediated knockout, TKO）系统，可通过插入终止密码子簇（stop codon cluster, SCC）实现精准的翻译终止，且框内突变发生率极低。目前TKO系统在水稻、玉米、小麦原生质体中的敲除效率分别可达70.5%、58.6%和75.1%。
该研究成果以《基于双先导编辑系统实现单子叶植物多重精准基因组编辑》为题发表于《自然·生物技术》（Nature Biotechnology）。
研究人员首先开发了这款精准高效的基因敲除工具TKO，其核心原理为在靶位点精准插入一段包含终止密码子簇的小片段。TKO系统通过精准插入终止密码子实现可预测的基因功能破坏，避免了Cas9系统中常见的、由3的倍数长度核苷酸插入/缺失（indel）导致的框内突变问题。
在原生质体实验中，TKO系统已在水稻、小麦、玉米等单子叶作物中展现出高效的敲除能力。在再生的T₀代水稻植株中，单基因敲除的平均效率可达96.8%。
为消除不同位点间的交叉编辑效应，实现精准安全的多重基因敲除，研究人员开发了10套正交TKO系统，可同时高效敲除最多10个基因。Cas9介导的多重编辑会因多个靶位点累积框内突变而丧失编辑效力，与之不同的是，即使同时编辑多个基因或同源基因拷贝，正交TKO系统仍可维持较高的敲除效率。
在TKO系统的基础上，研究人员进一步开发了TRIM1和TRIM2两套整合型基因组工程平台，二者共同构成统一的TRIM平台。
TRIM1将TKO系统与基于先导编辑的序列修饰功能相结合，可在同一编辑体系内同时实现基因敲除、碱基替换、插入、缺失、重复和倒位操作。在再生的T₀代水稻植株中，TRIM1同时实现1个基因敲除+3个额外靶位点纯合精准编辑的效率可达22.8%。
TRIM2整合了先导编辑器-Cre重组酶融合蛋白，可通过重组酶辅助的基因组工程技术，实现千碱基级的DNA插入、替换、缺失、倒位及染色体易位操作。
现有基因组编辑工具通常仅能完成数量有限的序列修饰，而TRIM平台将基因敲除、小片段精准序列编辑、大片段染色体工程三大功能整合到单一平台中。这种“一体化”平台为快速堆叠多个有利等位基因提供了强有力的工具，可推进单子叶作物复杂性状的精准育种进程。
【专业注释】
1. 双先导编辑：先导编辑优化亚型，支持长片段精准基因组修饰
2. 性状堆叠：将多个优异性状等位基因聚合到单一品种的育种策略
3. 正交编辑系统：组分无交叉反应，可独立执行编辑功能的体系