图注：CRISPR系统示意图[来源：filo / DigitalVision Vectors / 盖蒂图片社]
将CRISPR疗法直接递送至体内的最大障碍并非编辑化学反应本身，而是编辑器的尺寸。领域内常用的主力核酸酶（包括Cas9和Cas12a）氨基酸长度超过1300，分子量过大，无法装入体内基因治疗最常用的递送载体——腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）。这种尺寸不匹配导致目前多数临床应用只能依赖体外（ex vivo）编辑血液或骨髓来源的细胞，大量组织无法被靶向。长期以来，可包装入AAV且不损失编辑效率的小型CRISPR系统一直是领域缺失的关键工具。
近日发表于《自然·结构与分子生物学》（Nature Structural & Molecular Biology）的一项研究向上述目标迈出了重要一步。得克萨斯大学奥斯汀分校的研究团队及合作者报道了一种经挖掘和改造的紧凑型Cas12f核酸酶，其在人源细胞中具有优异的编辑活性；此前这类微型酶在哺乳动物细胞中的编辑效率普遍低于大型CRISPR系统，因此该进展具有标志性意义。论文标题为《Cas12f同源物的比较表征揭示基因组编辑效率提升的机制特征》。
研究团队首先从宏基因组数据集中筛选天然小型CRISPR酶，鉴定到一种此前未被表征的同源物：另枝菌属（Alistipes sp.）Cas12f（简称Al3Cas12f）。尽管其尺寸仅约为Cas9的三分之一，该核酸酶在人源细胞中展现出意料之外的高编辑活性：初步筛选结果显示，Al3Cas12f在多数基因组位点的编辑效率超过50%，部分靶点编辑效率甚至超过90%。作者在文中写道：“针对白蛋白基因（ALB）1号内含子、载脂蛋白A1基因（APOA1）3号外显子，以及PPP1R12C基因1号内含子内的AAVS1安全位点的gRNA筛选结果显示，共有27个靶点的编辑效率高于10%，19个靶点高于50%，其中AAVS1和APOA1位点共有10个靶点的编辑效率高于90%。”
冷冻电镜（cryo-electron microscopy, Cryo-EM）结构解析结果揭示了该微型酶效率超预期的分子机制：与其他Cas12f同源物相比，Al3Cas12f可形成更广泛、互锁的二聚体界面，组装为稳定的预组装复合物，支持高效R环（R-loop）形成。其向导RNA（guide RNA, gRNA）骨架也天然呈精简特征：与其他Cas12f的gRNA不同，它无额外茎环结构，紧凑构象可精准结合至蛋白结合口袋。正如作者所述，Al3Cas12f“通过稳定的二聚体界面和天然优化的gRNA实现高效R环形成”。
基于上述结构发现，研究团队进一步改造获得增强型变体Al3Cas12f RKK，可大幅提升全基因组范围多位点的编辑效率。在人源细胞中，该变体可将多数靶点的编辑效率从不足10%提升至80%以上，部分位点可达90%。研究人员还在白血病来源的人源细胞系中测试了该系统，靶向了与癌症、动脉粥样硬化和肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）相关的致病基因。
机制比较分析的结果同样具有重要启示：通过解析另外两种Cas12f同源物——摆动杆菌属（Oscillibacter sp.）Cas12f和食草瘤胃梭菌（Ruminiclostridium herbifermentans）Cas12f的结构，研究团队发现“调控原间隔序列邻近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）识别、gRNA结合、二聚化和DNA切割的结构与调控特征存在显著的种属差异”。Al3Cas12f的延长螺旋及类似榫卯的分子间相互作用是其谱系特异性的适应性特征，可稳定核酸酶构象并支撑高编辑活性。
后续研究将进一步测试该酶被包装入AAV载体后是否仍能保持稳定的编辑性能。若试验成功，该系统可为下一代紧凑型CRISPR工具的理性设计提供重要蓝图。
【专业注释】
1. AAVS1：人基因组中经验证的安全基因整合位点
2. R环：基因组中由DNA-RNA杂合链组成的三链核酸结构
3. PAM：Cas核酸酶识别并切割靶DNA必需的相邻短序列